血小板在活血化瘀中药研究中的应用

【前言】血小板在活血化瘀中药研究中的应用由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。[关键词] 活血化瘀；血小板活化；抗血小板活性评价；活性成分筛选 血瘀证是一类与血液、血液循环有关的病理过程，涉及呼吸、血液、内分泌、循环等多个系统，与心脑血管、肿瘤、糖尿病等多种疾病的发生、发展有关[1]。活血化瘀中药在治疗血瘀证方面具有悠久的历史，常...

[收稿日期] 2013-11-27

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81202886，21275169）

[通信作者] *杨丰庆，副教授，博士生导师，Tel：（023）65106615，E-mail：

[作者简介] 王凤琴，硕士研究生，E-mail：

[摘要] 不同形式的血栓性疾病严重威胁人类的健康，阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板聚集类药物是临床上常用的治疗用药。但随着西药抗血小板聚集药物抵抗性及副作用的出现，传统活血化瘀中药的抗血小板聚集研究逐渐成为一个重要方向。血小板是血栓形成的主要参与者之一，作为生物活性材料在活血化瘀中药研究中扮演着重要角色，主要包括中药抗血小板聚集活性评价及其活性成分筛选2个方面。该文针对近年来血小板在活血化瘀中药研究方面的应用进行了综述，为进一步的研究提供参考。

[关键词] 活血化瘀；血小板活化；抗血小板活性评价；活性成分筛选

血瘀证是一类与血液、血液循环有关的病理过程，涉及呼吸、血液、内分泌、循环等多个系统，与心脑血管、肿瘤、糖尿病等多种疾病的发生、发展有关[1]。活血化瘀中药在治疗血瘀证方面具有悠久的历史，常用的活血化瘀中药有上百种[2]。中医将活血化瘀中药大致分为以下几类[3]：和血药（如丹参、丹皮、生地黄、鸡血藤、当归、赤芍等）、活血药（如川芎、红花、蒲黄、益母草、五灵脂、郁金、三七、大黄、泽兰等）及破血药（如水蛭、血竭、三棱、莪术、桃仁等）。现代医药学研究发现，活血化瘀中药主要通过改善血流动力学、血液流变学、抑制血栓形成、抗动脉粥样硬化及心肌缺血、抑制炎症及肿瘤等过程发挥其活血化瘀作用[4]。

血小板是血液的重要组成部分之一，活化后具有黏附、聚集、释放等功能。当血管壁受损，血小板活化处于正常水平时，血小板能正常参与机体凝血机制[5]。同时，当血小板在受到诱导剂刺激时而致使血小板活化过高，血小板黏附性、聚集性、释放及代谢能力增强，此时血小板过度聚集形成血栓并参与炎症反应等。在血小板活化乃至血栓形成过程中，血小板释放二磷酸腺苷（ADP）和5-羟色胺（5-HT）等生物活性物质能进一步促进血小板的聚集和血栓的形成[6-7]，这会加剧许多病理过程的发生及发展，如动脉粥样硬化、肿瘤转移、冠心病、脑梗死等。因此，抗血小板药物例如阿司匹林在临床上对于心血管疾病的预防和治疗具有重要的作用。然而，近年来此类药物抵抗性及副作用的出现使得人们急需开发新的药效强、副作用小的抗血小板药物，而活血化瘀中药无疑成为此类研究的热点之一[8]。目前，许多活血化瘀中药已被证明具有抗血小板聚集活性，其中比较有代表性的是红花、丹参、川芎、银杏叶、三七、人参、葛根等[9]。近年来，血小板用于活血化瘀中药的研究主要包括2个方面，一是通过检测中药对血小板黏附、聚集、释放等功能的影响来评价中药的抗血小板活性、推断活血化瘀机制；二是通过考察活血化瘀中药成分与血小板膜受体的作用强弱筛选中药中的潜在活血化瘀活性成分。

1 血小板用于活血化瘀中药抗血小板活性评价

血小板活化程度过高是形成血栓的主要原因之一。血管受损及一些活化诱导剂（胶原、凝血酶、血小板活化因子、二磷酸腺苷等）均能引起血小板的活化。处于活化状态的血小板的黏附性、聚集性增强。黏附性是指血小板与非血小板表面相互黏附，血小板黏附于血管内壁后即发生聚集反应。血小板聚集是指血小板之间的互相黏着，是血栓形成中较为关键的一步。

活化的血小板的物质代谢会发生显著性变化，主要有：①血小板内颗粒释放的特异性物质增加，包括P-选择素（CD62P、血小板α颗粒膜蛋白140），β-血小板球蛋白（β-TG），血小板第4因子（PF4），CD40L或可溶性CD40L（sCD40L），GPⅡb/Ⅲa复合物，5-HT，CD63等；②血小板内花生四烯酸代谢增加，包括血栓素A2（TXA2），血栓素B2（TXB2）及11-脱氢TXB2（11-DH- TXB2）；③血小板活胞内第二内信使钙离子上升及环磷酸腺苷（cAMP）下降。在这些物质中，有的是血小板活化时才表达，可以特异性表征血小板的活化水平，如P-选择素是目前最具特异性的表征血小板活化的分子，被认为是活化血小板标志物的金标准；而有些物质能进一步促进血小板聚集及血栓形成，如5-羟色胺能激活血小板并强化胶原、ADP等对血小板聚集的作用。因此，血小板或血浆内的此类物质的量也被广泛用于评价活血化瘀中药的抗血小板聚集活性，并且比血小板黏附性和聚集性实验更为灵敏。

中药抗血小板活性评价一般包括体外实验（in vitro）、活体外或离体实验（ex vivo）及体内实验（in vivo），测试项目包括血小板黏附性、聚集性及相关物质检测，有时还辅助以体内动物血瘀模型实验对评价方法进行验证。活性评价的一般过程是：①实验动物分组给药（体内实验或活体外实验）；②取血，制备富血小板血浆（PRP）或血小板悬液（WP），并保持一定的血小板浓度；③PRP（WP）中加入诱导剂，分别测试血小板黏附性及聚集性变化；④用相应的酶免疫测定试剂盒、流式细胞术等方法测试血小板释放物及代谢物的改变；⑤血瘀模型相关参数的观察及测定，主要包括出血时间、凝血时间、凝血酶原时间、活化部分凝血酶时间、凝血酶时间等。

近年来，许多文献报道了有关通过检测用药后血小板黏附性、聚集性及血小板相关释放物、代谢物的变化来评价中药抗血小板作用及药理机制研究的方法及应用，研究对象包括传统活血化瘀中药活性成分、单味中药提取物（表1）[10-63]、中药复方（表2）[64-83]、中成药（表3）[84-107]。研究对象大多表现出了体外或（和）体内抑制血小板黏附、聚集及释放、代谢活性；同时，相应的活体内药理辅助实验也证明了此类药物的抗血栓作用。甲磺酸胺银杏内酯B是血小板活化因子拮抗剂银杏内酯B的衍生物。刘成鼎等[10]通过比较空白对照组、各剂量组及阳性对照组中家兔血小板黏附性大小及释放物的含量对其抗血小板作用进行了研究。实验结果显示，甲磺酸胺银杏内酯B能抑制胶原引起的血小板黏附，降低血小板活化因子（PAF）引起的5-HT，β-TG及PF4的释放。这说明甲磺酸钠银杏内酯B具有较好的抗血小板活化作用。并且，相比于银杏内酯B，甲磺酸胺银杏内酯B具有较好的水溶性，可开发为注射液，在一定程度上解决临床上银杏内酯B使用受限的问题。桃红四物汤具有较好的活血化瘀作用，韩岚等[66]采用旋转玻球法、比浊法、酶联免疫吸附法分别测定桃红四物汤对正常及造模血瘀大鼠的血小板黏附性、聚集性及释放物质的变化。结果显示，桃红四物汤能有效地抑制正常大鼠血小板黏附及ADP和肾上腺素诱导的血小板聚集，降低造模大鼠血浆内vWF，TXB2，GMP-140的含量及TXB2/6-keto-PGF1α比值。说明桃红四物汤对血小板活化过程中黏附、聚集及释放3个阶段均有一定的抑制作用，并由此推断，桃红四物汤的抗血小板活化活性与其能够降低血小板vWF及GMP-140含量，抑制TXB2生成，调节TXB2/6-keto-PGF1α平衡有关。在诸多相似的研究中，香橼[31]、黑豆[62]、西芹[63]等食材也表现出抗血小板活化及抑制血栓形成活性。

2 血小板用于活血化瘀中药潜在活性成分色谱法筛选

受体理论认为：药物发挥药效的前提是药物与受体的特异性结合。药物的亲和性（与受体的结合能力）一定程度上反映了药物的药效强弱。基于此，血小板作为附有多靶点的生物介质被逐渐用于活血化瘀中药中抗血小板活性成分的筛选研究。

目前常用的方法是一种离线的血小板膜固相色谱法[108]（即固相萃取结合色谱分析法）：首先，建立中药提取物的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱；然后，保持生物活性的离体血小板用中药提取物在适宜温度下孵育一段时间，离心过滤；对未结合成分的洗脱；破坏血小板释放与血小板结合成分，离心过滤，用相同的色谱条件分析与血小板结合的成分；最后，对比中药提取物的HPLC指纹图谱，确定与血小板结合的成分。通常情况下，该方法亦结合质谱技术（MS）对成分进行结构鉴定。

Yu等[109]用血小板膜固相色谱法研究脉络宁注射液中的活性成分，筛选出5个能和血小板有较强结合作用的物质：新绿原酸、咖啡酸、异绿原酸及它们的异构体。用流式细胞术测定结果显示咖啡酸能显著抑制P-选择素的表达。Wang等[110]用血小板膜固相色谱法研究三七中的抗血小板聚集活性成分，筛选出5个能与血小板特异作用的成分，其中4个被确认为腺苷、鸟苷、人参皂苷Rh1及人参皂苷F1，并且通过血小板聚集实验验证了三七中的腺苷和鸟苷有抗血小板聚集的活性。由此说明固相色谱法筛选活血化瘀中药活性成分具有一定的可靠性。另外，贾俊[111]、赵黄刚[112]、樊宏伟[113]等用类似的方法筛选分析了红花、三七及丹参提取物的潜在抗血小板聚集活性成分（表4）。

血小板电色谱法作为一种在线分离分析技术也用于活血化瘀中药的筛选。吕瑞等[114]用物理吸附法将血小板部分涂覆在毛细管内壁上，测定血小板在不同涂覆长度时毛细管内的淌度变化计算中药丹参水提物和三七乙醇提取物中的成分与血小板的结合常数，结合常数的大小反映成分与血小板结合能力的大小及抗血小板活性的大小。结果显示，三七醇提物中的腺苷的结合常数较大，这与以往有关腺苷抗血小板聚集活性的研究相吻合，说明血小板能有效地用于电色谱法筛选中药抗血小板活性成分。在该研究方法中，血小板通过物理吸附法被固定在毛细管内壁，最大限度地保留了其生物活性；采用部分涂覆的方法能显著提高电渗流，提高分析 效率。涂层血小板电色谱法结合了毛细管亲和电泳和电色谱的优点，能够直观地表现药物与血小板作用的动力学参数，是一种比较有应用前景的活血化瘀中药活性成分筛选方法（表4）。

3 血小板在活血化瘀中药研究中存在的问题

3.1 活性评价方面 目前，活血化瘀中药抗血小板活性评价研究已经取得一定的进展。大量的实验结果论证了一些常见活血化瘀中药、复方及成分的抗血栓机制[8]。同时，该方法还用于研究一些没有文献记载但在民间确有疗效的中药的抗血小板活性。如李静等[115]通过研究发现香椿子正丁醇提取物能抑制凝血酶引起的血小板细胞内钙离子浓度上升及血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体表达，并可以初步推测该抑制作用与其抗凝血及抗血栓作用相关。但是，活血化瘀中药抗血小板药理研究还存在一些不足：①黏附性和聚集性测试不灵敏，目前多数抗血小板聚集测试仍采用传统的比浊法，而此方法受血样因素影响大，在反映中药血小板聚集性方面不够灵敏；②药理研究主要在药效的观察方面，分子水平药理机制的研究较少[8]；③机制研究方面仅仅是通过观察检测推断药理机制，有待于进一步的严密实验验证。如研究结果[116]显示人参皂苷Rg1能抑制大鼠血小板聚集，但血小板内cAMP没有变化，并依此推断人参皂苷不是通过升高血小板内cAMP含量来抑制血小板活性，诸如此类的结论尚待进一步深入的研究。

3.2 色谱法筛选活性成分方面 血小板作为介质用于色谱法活血化瘀中药抗血小板活性成分研究是一种在受体理论指导下的快速、高效活性物质追踪方法，已较为成功地用于三七、丹参、红花等活血化瘀中药潜在活性成分的筛选中，但是此方面的应用还存在一些不足：①血小板在用于色谱法筛选活血化瘀中药活性成分主要集中在血小板膜固相色谱法。在此方法中，药物筛选过程和物质分离鉴定过程是分开的，不能反映血小板和药物作用的动力学参数[117]，无法直接反映不同成分之间的相对活性大小，药物的作用效果仍需进一步的药理实验验证。生物色谱是近年来发展起来的一种在线分析药物与受体特异性作用的技术，已有红细胞、血管内皮细胞、白细胞、巨噬细胞、心肌细胞等活细胞及细胞膜用于中药活性成分筛选研究[117]，但鲜有血小板在此技术上的应用。所以，血小板作为一种活性生物材料也有待于在生物色谱法筛选活血化瘀中药方面得到发展及应用。②用涂层毛细管电谱法测定了丹参水提物及三七醇提物与血小板的结合常数，是血小板用于在线药物分析的初步尝试。但实验结果和以往研究还有不相符的地方，方法条件等问题还有待改进。基于血小板膜受体生理活性及已有的血小板筛选分析方法，可以展开血小板在生物色谱或毛细管亲和色谱方面的应用研究，为活血化瘀中药筛选及药理活性研究提供方法学基础。

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