磁微粒化学发光酶免疫分析法检测血清f-PSA方法学建立

摘要:本研究建立了一种定量分析人血清中游离前列腺特异性抗原(f-PSA)的高灵敏度磁微粒化学发光酶免疫分析方法。采用了一步双抗体夹心法,将单克隆抗体连接在磁微粒表面,以辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)为标记酶,结合鲁米诺(luminol)高灵敏化学发光反应为检测体系进行深入研究。建立检测试剂的主要指标:检测范围0.02～50ng/ml;最低检出限0.02ng/ml,分析内变异

关键词:游离前列腺特异抗原,磁微粒化学发光酶免疫分析法,肿瘤标志物

Key words: prostate specific antigen,microbeads-based chemiluminescence immunoassay. Tumor marker

Gao wei

Kaifeng City Maternity Hospital

[Abstract]A sensitive chemiluminescence enzyme immunoassay based on magnetic micro-beads was established to detect the free prostate specific antigen (f-PSA) in human serum. One antigen was coated on the magnetic micro-beads and the other was labled with horseradish peroxidase(HRP), with the highly sensitive Luminol chemiluminescence reaction as the detection system. The linear range of this method for PSA was 0.02~50ng/ml with the limit detection of 0.02 ng. The intra-assay coefficients of variation is lower than 4.7% and the percent recovery was in the range of 90%~110%. F-PSA in 510 clinical samples were detected with this method. Compared with Roche chemiluminescence immunoassays, the correlation coefficient of 0.995 was obtained. The results demonstrated that this method is reliable and shows proposed potential application in the clinical analysis of f-PSA for prostate cancer diagnosis.

前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen, PSA)是人体前列腺上皮组织细胞分泌的一种分子量为30～33 kDa的单链糖蛋白分子[1～3]。前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)病人血清中PSA浓度升高;良性前列腺增生(Benign Prostate Hyperplasia, BPH)病人血清中,PSA浓度也会升高;随着年龄的增加,血清中PSA浓度也有不同程度的升高,在4～10 ng/ml的浓度范围就形成了诊断灰区[4~6]。PCa病人血清中f-PSA浓度水平与BPH病人以及正常人相比,明显偏低,游离前列腺特异抗原百分率对PCa的特异性更高,可降低临床检验筛查的假阳性率。建立特异性强、检测灵敏度高的新型f-PSA检测试剂将会对前列腺相关疾病的检测具有较高的临床应用价值。

1.材料及方法

1.1试剂: PSA、fPSA单克隆抗体购自美国Seradyn公司;辣根过氧化物酶、鲁米诺购自sigma公司;f-PSA化学发光免疫分析(CLIA)试剂盒购自Roche公司。

1.2仪器:LUMO微孔板化学发光检测仪、IWO型洗板机(郑州安图生物工程有限公司);罗氏ELESYS2010电化学发光仪。

1.3临床样本:临床样本由肿瘤医院提供。

2.实验方法

2.1 方法学原理:选用一步反应双抗体夹心法检测f-PSA抗原。磁微粒表面结合PSA单克隆抗体;加入待检测校准品、临床血清和酶标记抗体;温浴反应后形成固相抗体-抗原-酶结合抗体的复合物,通过洗涤分离游离的抗原和酶标记抗体,加入发光底物,使用化学发光检测仪检测信号强度,结合标准曲线来实现对待测样品的定量分析。

2.2 抗体包被磁微粒:将300mg磁微粒分散于2ml包被液(0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液)中,室温下振荡4h,用20ml封闭液(0.5%BSA,pH 7.5磷酸盐缓冲液)封闭4h,最终使用封闭保存液调整磁微粒浓度30mg/ml,密封置于冰箱2～8℃保存备用。

2.2HRP抗体酶结合物的制备:采用改良过碘酸钠法完成HRP对f-PSA单克隆抗体的标记,酶结合物保持单克隆抗体的免疫反应活性和酶的催化活性。

2.3f-PSA校准品的配制:校准品经由国家标准标定,分装,冷冻保存。

2.4血清f-PSA的化学发光酶免疫分析方法:向微孔板中每孔加入校准品或样品50μL,磁微粒50μL,酶结合物溶液100μL,37℃温育30min,使用磁分离洗涤设备洗涤4次,加入发光底物100μL,室温避光反应5 min,测量相对发光强度单位(RLU),通过标准曲线对血清中f-PSA实现定量分析。

3.结果分析

3.1 包被浓度的影响:比较不同的包被浓度(1.0、2.0、3.0和5.0 ug/ml)对体系的影响。随着包被浓度的提高,校准品信号值升高,浓度达到3ug/ml后,校准品对应发光值开始下降,认为3ug/ml的包被浓度已经达到饱和。

3.2酶结合物浓溶优选:将酶结合物分别以1∶1000、1∶2000、1∶3000进行稀释,比较不同分析结果的影响。结果表明,在1∶2000稀释比条件下,校准品信号值、灵敏度、线性、HOOK值检出均达到最佳。

3.3温育时间:考察了不同温育时间对反应体系的影响,温育时间超过30min后,校准品信号值不再升高,表明免疫反应达到饱和,最终确定温浴时间为30min。

3.4温浴条件:考察了三种不同的温育方式,即4度、室温和37℃对反应体系的影响。37度时RLU较室温反应提高57%,同时考虑37℃恒温温育的条件更容易控制,选择37℃恒温温育作为温育条件。

3.5 性能评价

根据国家相关化学发光检测试剂质量标准,对建立的磁微粒化学发光f-PSA进行评价,结果如下:

临床考核研究选用本院电化学发光检测试剂为对照组。自2009年7月以来,收集经病理中心确诊前列腺患者血清样本43份、前列腺炎患者血清样本142份,随机收集正常男性血清样本325份。血清按照检测试剂盒要求采集的非抗凝血清,样本需清亮不混浊、样本量不少于300μl。采集后2~8 ºC冷藏,如1天内不检测,则应冷冻(-20ºC)保存,不得反复冻融。其测定值相关性及相关系数分别为:Y(磁发光) = 1.0075x (Roche)+ 0.0386R= 0.9953

4 讨论

本方法为化学发光酶联免疫系统与磁性微粒分离技术相结合的一种测定方法,它使双抗体夹心酶联免疫技术在游离标记抗体和抗原复合物中具有分离完全和快速的优点。建立的f-PSA检测方法重复性良好,线性范围宽,具有较高的精密性和准确度,特异性强。经过对510份临床血清研究表明与电化学发光检测结果符合程度达到0.99以上。

此方法操作简便、快捷,全部测定时间仅需40分钟,显著提高工作效率,满足医生及病人即刻出结果的要求。

参考文献:

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