大鼠肝脏中丙烯酰胺代谢的初步研究

摘要：丙烯酰胺（acrylamide，Acr）具有神经毒性、遗传毒性和潜在的致癌性，食品中丙烯酰胺的存在及食用安全性引起了国际社会的高度重视。试验选用Sprague—Dawley雄性大鼠80只，体重180-230g，鼠龄50d，随机分成4组进行Acr染毒实验，染毒剂量分别为0、25、50、100 mg／Kg，即对照组和低、中、高3个剂量组。对照组使用生理盐水，染毒采用腹腔注射，隔日染毒，连续12周。分别在第3、6、9、12周末次染毒4 h后处死取样。RT-PCR进行肝脏P4502E1mRNA的表达分析，来观察Acr对大鼠肝脏P4502E1的活力及表达的影响。得出以下结果：大鼠肝细胞中P4502E1mRNA的表达，在染毒第12周以50mg/Kg剂量组表达量最高，25mg/Kg、100mg/Kg剂量组在第6周mRNA表达表现出峰值。本实验研究丙烯酰胺肝脏代谢特点及P4502E1mRNA在肝脏丙烯酰胺代谢过程中的变化，为进一步探讨丙烯酰胺代谢途径及其毒性作用奠定了基础。

关键词：丙烯酰胺；环丙氧酰胺；细胞色素P4502E1

中图分类号：R363 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2012）-07-0049-2

0 前言

环境中存在的丙烯酰胺均是人为引入，其主要来自于污水处理,尤其是塑料业可释放大量的丙烯酰胺。当丙烯酰胺进入人体，可在人体内有蓄积作用，达到一定的蓄积量，就能够导致周围神经病变和小脑功能，并且与肾上腺癌、甲状腺癌、乳腺癌和生殖系统癌症的发病率存在一定的剂量暴露关系。因此，1994年，国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)已经将其列为人类的可能致癌物质。由于丙烯酰胺具有潜在的神经毒性、遗传毒性和致癌性，其暴露范围已经扩大。因此，食品中丙烯酰胺的存在引起了国际社会的高度重视。为此，2002年6月25日世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)召开了食品中丙烯酰胺问题专家咨询会议，对食品中丙烯酰胺的食用安全性进行了探讨。经动物实验确认丙烯酰胺是一种致癌物。在对小鼠细胞进行的体内和体外培养中发现丙烯酰胺会破坏小鼠的遗传物质DNA和RNA。但是对职业暴露人群进行调查，暴露于丙烯酰胺环境中的人因患癌症死亡的比例相对于普通人群并无明显增加。因此，丙烯酰胺在人体中的致癌性还存在一定的争议。

1 试验材料

Sprague—Dawley雄性大鼠80只，体重为180-230g，鼠龄50 d，由中英合资上海SIPPR/BK公司供应，清洁级。

将80只大鼠随机分成4组，即对照组和低、中、高3个剂量组，首先进行适应性饲养l周后开始染毒。以腹腔注射的方法，染毒剂量分别为0、25、50、100mg／Kg。染毒时按等体积不同浓度用蒸馏水配成Acr稀释液。对照组给予等体积的生理盐水。隔日染毒，连续12周。

分别在实验3、6、9周的末次染毒4h后，各组随机抽取4只大鼠，腹腔注射氯胺酮麻醉大鼠，并立即取出肝脏，使用预冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干后，迅速切成小块立即置于液氮罐中，-70℃保存备用。对照组大鼠断头处死，在无菌条件下取肝脏，置于预先以氧饱和的冰KH(Krebs Henseleit，克雷伯-享斯雷特循环)缓冲液中。

2 方法

2.1 总RNA的提取

将称取好的肝脏提取总RNA，溶于DEPC水，-70℃保存备用。

2.2 总RNA的纯度及浓度的测定

提取的总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，分光光度计测RNA含量。

2.3 P4502E1逆转录

设计P4502E1mRNA引物及内参，逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)按试剂盒说明进行操作。

P4502E1扩增：扩增产物410bp，上游引物5ˊ-CTCCTCGTCATATCCATCTG-3ˊ；下游引物5ˊ-ATTACCCTGTTTCCCCATTCC-3ˊ。

选择β－肌动蛋白（β-actin）为内参，（扩增产物194bp）。上游引物5ˊ-TGACGTTGACATCCGTAAAG-3ˊ；下游引物5ˊ-ACAGTGAGGCCAGGATAGAG-3ˊ。

以上引物均由Primer Premier 5 软件设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。结果用Quantity One? 1-D分析软件进行图像分析，用P4502E1与β-actin扩增条带的比值表示P4502E1 mRNA表达的相对水平。

3 统计学处理

数据在Excel中建立数据库，应用SPSS10.0统计分析软件进行方差分析及多重比较。

4 结果与分析

4.1 肝微粒体P4502E1 mRNA表达

P4502E1mRNA表达测定结果：从表1、图1可见，同一时间不同剂量组的比较发现，随剂量的增加P4502E1mRNA相对表达量也增加。25、100mg/Kg剂量组在第6周mRNA表达表现出峰值，差异极显著(P＜0.01),随后P4502E1mRNA表达呈现下降趋势。在染毒第12周以50 mg/Kg剂量组表达量最高，差异极显著(P＜0.01)（见图2）。

注：1.同列小写字母b表示差异显著（P＜O.05），大写字母B表示差异极显著（P＜O.01）。

2.a表示同行数据比较差异不显著，c表示同行数据比较差异显著（P＜O.05），A表示差异极显著（P＜O.01）。

4 讨论

丙烯酰胺研究的试验动物模型比较广泛，包括哺乳动物、禽类和水生动物等，在细菌和线虫内也有研究。其中运用最多的是大小鼠，又以大鼠与人体的丙烯酰胺代谢情况比较接近。本试验以腹腔注射的方法染毒，Acr染毒剂量分别为0、25、50、100 mg／Kg。对照组给予等体积的生理盐水，隔日染毒，连续12周。在第12周末未发现导致大鼠出现感觉－运动型周围神经和中枢神经病变，说明在时间、剂量的设计上还存在问题，还不足以产生中毒症状。本实验的大鼠未出现中毒症状，可能是由于品系的关系，但不影响对其进行病理研究。