石斛组织培养与移栽的研究

摘要

石斛又叫石斛兰，兰科石斛属植物。是我国古文献中最早记载的兰科植物之一。 本实验用1/2MS为基本培养基,添加不同的激素配制三种不同的培养基进行石斛兰试管苗快速繁殖和移栽的研究。结果表明:1/2MS-C配方石斛兰原球茎增殖最快。再按照1/2MS-C配方分别用纯净水[1]、蒸馏水[2]、自来水[3]作溶解剂配制三种不同的培养基对石斛进行组织培养，经多次试验后发现配方[1]石斛原球茎的增殖速度最快，数量最多。

关键词：石斛、组织培养、移栽

中图分类号：S223文献标识码： A 文章编号：

前言

植物的组织培养（tissue culture）是指通过无菌操作把植物体的器官、组织或细胞（即外植体）接种于人工配制的培养基上,在人工控制的环境条件下，使之生长, 发育成植株的技术与方法。由于培养物是脱离植物母体在试管中进行培养，所以也叫离体培养，或植物的细胞与组织培养。 植物组织培养是建立在植物细胞全能性学说的理论基础上，经过长期反复科研实践，逐步发展形成一套较为完整的技术体系。近二十年来，利用植物组织培养的方法不但在探求植物学的基本理论问题上已成为一个重要的手段，而且在应用上也逐渐表现出了它巨大潜力。在农业、林业及园艺等方面，组织和细胞技术已经用来培育作物新品种，复壮特殊的无病毒无性系，以及快速繁殖植物的无性系等。在花卉及草本植物方面，用无性繁殖系快速繁殖植株，使植物的生产工厂化和试管品种商品化，使目前植物组织和细胞培养在应用上的新动向。 园艺植物绝大多数良种是采用无性繁殖，以保持其优良性状的遗传稳定性和一致性。但传统的无性繁殖方法繁殖的数量小、速度慢，而离体培养繁殖的技术特点是繁殖系数大，周年生产，繁殖速度快，苗木整齐一致。例如兰花离体繁殖，一个外植体一年可繁殖400万个原球茎。兰科植物种类繁多，约有450个属.石斛兰属是兰科中最大的一个属，有一千多个种，在我国主要分布在西南和华南地区。 石斛又叫石斛兰，为兰科石斛属植物。是我国古文献中最早记载的兰科植物之一。石斛由于花形、花姿优美，艳丽多彩，种类繁多，且花枝长、花多、花期长，深受各国人民的喜爱和关注，在国际花卉市场上占有重要的位置。石斛是多年生落叶草木。茎丛生，直立，上部略成回折状，稍偏，黄绿色，具槽纹。叶近革质，矩圆形。总状花序，花大，白色，顶端淡紫色，落叶期开花。原产亚洲热带，喜高温多湿和一定光照。生长适温为25～30℃，冬季温度不低于10℃，常绿种类不低于15℃，喜温差在10～15℃，温差过小，影响枝叶生长。 石斛中有些种如铁皮石斛、金钗石斛等是名贵中药材，具有养胃生津、滋阴清热的功能，在我国传统医学上的应用历史悠久。石斛也是一种重要的观赏植物。几乎所有观赏植物栽培的石斛兰都是杂种。通过种子繁殖不能得到大量与亲代性状一致的植株。分株繁殖又速度太慢，满足不了生产上的需要。1967年Sagawa和Shoji报道了通过培养分生组织无性繁殖石斛兰的技术：从石斛兰幼茎的侧芽和顶芽上去切取芽的分生组织，培养在Konp C培养基上。3个月后，20％的顶芽和29 ％的侧芽分化出原球茎（Protocom-like bodies）。这些原球茎既可增殖，也可分化成完整的植株。继后，Kim、Kunisaki、Sagawa在加有椰子汁的Vacin 和Went培养基上成功的诱导了石斛兰的芽分化组织产生原球茎，并证明了长约5cm的幼茎上切取的外植体最好；顶芽和侧芽的诱导成功率分别为46.6％和 50.9％。 我们用组织培养技术建立了石斛兰的快速繁殖系。原球茎每隔20～30天即能繁殖几倍，在增殖过程中不断分化成小植株，繁殖迅速。此次，我们所进行的实验只是有关石斛兰在不同培养基上生长繁殖的初步研究，希望能够对有关石斛兰组织培养的研究起到辅助作用。

材料与方法

1.实验材料供试品种为天津农学院提供的石斛兰2.实验方法2.1培养基的配制2.1.1以1/2MS为基本培养基，按照需要添加不同激素（NAA、IBA、6-BA）的培养基的配制。

先取适量去离子水溶解10g蔗糖，倒入1000ml容量瓶中，再用每种试剂母液专用的移液管取1、2、3、5号母液各10ml，4号母液2ml一一放入容量瓶中，再取0.4mol/l NAA加入容量瓶，并加入去离子水定容至1000ml。摇匀后倒入适当大小的蒸锅中，再取0.5g牛肉膏和7g琼脂粉加入蒸锅一同加热溶解，然后加入1.0mol/l的NaoH 10滴调节PH值至5.4～6.0之间。配制好培养基A: 1/2MS+0.4mol/lNAA 配制好的培养基要趁热分注，把培养基倒入已灭菌的三角瓶中，至容器的1/5左右，拧紧瓶盖，最后准备消毒培养基。 按照同样的方法，分别取0.4mol/lNAA和0.2mol/l6-BA、0.4mol/lIBA和0.2mol/l 6-BA加入2个不同的1000ml容量瓶中，其他成分方法与A培养基相同。配制好培养基 B和C。两种培养基趁热分别倒入已准备好的三角瓶中，至容器的1/5左右，拧紧瓶盖，最后准备消毒。设处理如下：A:1/2MS+0.4mol/lNAAB:1/2MS+0.4mol/lNAA+0.2 mol/l 6-BAC:1/2MS+0.4mol/lIBA+0.2 mol/l 6-BA2.1.2以1/2MS为基本培养基，按照需要用不同的水（纯净水、蒸馏水、自来水）作溶解剂的培养基的配制 按照2.1.1中C培养基的配方和配制方法，分别用纯净水[1]、蒸馏水[2]、自来水[3]代替去离子水作为溶解剂配制成三种不同的培养基。然后将配制好的培养基趁热 分注，分别倒入已灭菌的三角瓶中，至容器的1/5左右，拧紧瓶盖，最后准备消毒。

2.2培养基的消毒

用高温高压灭菌锅消毒。消毒锅中加入适当的水，再把装有培养基的三角瓶放入消毒篓中。装好后将锅盖拧紧，接通电源。当压力升至0.5kg/cm2时，打开排气阀排出锅内的冷空气，然后关闭排气阀；当压力再次升至0.5kg/cm2时，又一次打开排气阀排出锅内的冷空气，之后将排气阀关闭（放气两次）;压力继续上升至1.1kg/cm2时，锅里的温度为120℃左右，保持压力在1.1～1.2kg/cm2之间，持续20分钟，即可达到灭菌的目的。之后切断电源，让灭菌器自然冷却，冷却后把培养基从中取出，至于温度低于30℃，没有强光照射的专用柜中备用。

2．3 接种

2．3．1 无菌操作前的准备

先将接种室中的酒精灯、盛有半瓶75%酒精250ml 的广口瓶，操作时用的镊子、培养基、烧杯等放在超净台的台面上，然后用紫外灯照射消毒30~60分。在无菌操作前10分钟先使超净台处于工作状态，让过滤室空气吹拂工作台面和四周台壁，并用75%酒精在室内喷雾，以净化空气。

2．3．2无菌操作

2．3．2．1培养材料的处理

培养材料的处理在消毒室中进行。首先选取初生嫩茎，从植株基部切离，然后取2～3cm长的茎芽切段，在无菌操作下，除去外部的叶片，用自来水冲洗干净，晾干，分别在75%乙醇和0 .1 %Hgcl2的溶解液中灭菌一定时间，用无菌水冲洗4～5次。

2．3．2．2接种

工作人员穿好工作衣帽，戴上口罩，坐在超净台前，在台面上用75%的酒精擦拭双手和台面，并消毒烧杯和培养瓶等。消毒后片刻，待工作台面上的酒精挥发后点燃酒精灯，这时酒精灯火焰会因风吹而向工作人员倾斜，倾斜的酒精灯火焰与工作人员之间靠近火焰处形成一个高温洁净区，接种的操作应在这一高温洁净区进行。操作时打开三角瓶的塞子前，要用火焰烧瓶口，用硫酸纸做瓶盖的三角瓶，要在火焰附近打开盖子，把尘灰固定在瓶口上，以杀死细菌类。操作时试管应拿成斜角，以减少污染并便于操作。工作时所用的镊子每用一次要蘸酒精，并在酒精灯上烧烤，之后把镊子深入培养基，以降低温度并防止损害材料。然后把石斛兰的原球茎分成几块，稍稍倾斜插在培养基里，不要过深夜不要过浅，深度要适当。一般稍大的原球茎每瓶接2~3个，稍小的每瓶接4~5个。最后把三角瓶瓶口和盖子在火焰上烧烤后并拧紧。工作中不要说话，双手操作要在工作台以内，不可移出工作台，其他人员也不许伸手从工作台上拿或放任何东西。

2．4培养

接种后的三角瓶移入培养室，放在培养架上，所有的培养物都在光照下培养。培养室的温度为25±1℃,光强约为1000lx,每天光照12小时，诱导花芽分化。培养一定时间后，对原球茎的增殖、原球茎发芽、褐变及污染等情况进行了调查和统计。

2．5试管苗的移栽

试管苗的移植是从“异养”到“自养”的转变，需要有一个逐步适应的过程，因此移植之前试管苗必须提高光照进行练苗，让植株生长健壮，增强小苗体质以提高移苗成活率。同时进一步将三角瓶打开盖子，至于室内自然光照下放3天。然后将培养基中的小苗小心地从三角瓶中取出，用温水洗净小苗根部的培养基，装入底部垫有碎片并且用泥炭、树皮、苔藓混合的基质中去，立即用细眼喷水后加玻璃或塑料罩，3~4日内不可浇水，以后浇少量清水，1周后见叶片挺直，可去罩用营养元素减半的营养液浇灌，4周后可作常规栽培管理。

结果与分析

1.本实验以1/2MS为基本培养基，添加不同的激素配制成三种不同的培养基对石斛进行组织培养；另外按照上述培养基[3]的成分和配制方法用三种不同的水作溶解剂制成三种培养基对石斛进行组织培养。

2.原球茎的诱导发生

接种两周后，所有存活又没有污染的芽都明显地增大。由于鳞片状叶的生长，侧芽在培养过程中长成半球型，并进一步发育成带叶的幼茎。偶尔有些侧芽的基部产生不定芽。这些不定芽后来也发育成幼茎。

为了使侧芽分化出原球茎，当它们长成半球型时，其上的鳞片状叶被移去，并把周围变褐的组织切去。再将芽转移到1/2MS培养基中。约经一个半月，分化的绿色原球茎，在解剖镜下观察，原球茎表面有圆球突起，上面分化出许多毛状的突起。

3.原球茎的增殖

早期原球茎状体外观像愈伤组织，表面球状物不明显。继续培养，可见表面突起一个个圆球，部分分化出根毛状物。如果不切割原球茎状体，让它们在不含或只含低浓度细胞激动素的培养基里继续生长，60天后长出芽，成为完整的原球茎。100天后，大部分已长成2～3片叶的小苗。为达到大量繁殖的目的，必须加快原球茎增殖速度，在原球茎状体阶段进行增殖是最理想的。

切开刚发生的石斛原球茎，移植于与诱导培养相同成分的液体培养基中，则能分化出绿色丛生原球茎，但原球茎状体形成后，在无菌条件下取下切成小块，分别在1/2MS-A方(1/2MS+0.4mol/lNAA)，1/2MS-B配方(1/2MS+0.4mol/lNAA+0.2mol/l6-BA)和1/2MS-C配方(1/2MS+0.4mol/l IBA+0.2mol/l6-BA)的三种不同的培养基中继续培养。在这三种培养基中，原球茎的增殖和发芽情况明显不同。其中A配方原球茎的增殖数为117个，平均增殖倍数为2.60;B配方原球茎的增殖数为94个，平均增殖倍数为2.35,;C配方原球茎的增殖数为162个，平均增殖倍数为3.60;.A配方原球茎的发芽数为279个，平均每个原球茎发芽倍数为6.20;B配方原球茎的发芽数为226个，平均每个原球茎发芽倍数为5.65;C配方原球茎的发芽数为306个，平均每个原球茎发芽倍数为6.80。结果表明：C配方原球茎的增殖（见表1）和发芽（见表2）效果最好。

表1 石斛兰原球茎在三种不同激素培养基中增殖分化培养结果

表2石斛兰原球茎在三种不同激素培养基中发芽培养结果

根据C配方原球茎的增殖和发芽效果最好，又将原球茎状体在无菌条件下取下切成小块，分别培养在[1]配方（纯净水）、[2]配方（蒸馏水）和[3]配方（自来水）的三种不同的培养基中。三种配方进行对照发现：[1]配方原球茎的增殖数为147个，平均增殖倍数为3.50;[2]配方原球茎的增殖数为117个，平均增殖倍数为3.25;[3]配方原球茎的增殖数为88个, 平均增殖倍数为2.20。[1]配方原球茎的发芽数为189个，平均每个原球茎发芽倍数为4.50;[2]配方原球茎的发芽数为99个，平均每个原球茎发芽倍数为2.75; [3]配方原球茎的发芽数为98个，平均每个原球茎发芽倍数为2.45。结果表明：[1]配方原球茎的增殖（见表3）和发芽（见表4）效果最好。

表3 石斛兰原球茎在三种不同溶解水的培养基中增殖分化培养结果

表4石斛兰原球茎在三种不同溶解水的培养基中发芽培养结果

综上所述，1/2MS-C配方和[3]配方培养基中，所分化出的绿色丛生原球茎生长最好，发芽倍数最高，由此可以再分割。由球状分生组织再继续繁殖，这就建立了无性繁殖系。在增殖培养过程中，每隔20～30天即能切割繁殖几倍。

4.植株的形成

原球茎在增殖时形成的小植株的数量时多时少，没有规律。原球茎转移到1/2MS培养基后，从原球茎上很快分化出芽和根。8～10周后，每个原球茎就发育成具有良好根系的植株。

5.在实验过程中，我们经多次实验得到以下几点结论：

原球茎状体的诱导发生、增殖和发芽与激素的种类，浓度有关。经对1/2MS-A配方，1/2MS-B配方和1/2MS-C配方多次实验后发现三种配方中1/2MS-C配方(1/2MS+0.4mol/lIBA+0.2mol/l6-BA)最容易促进石斛原球茎的增殖和发芽。

此外原球茎状体的诱导发生、增殖和发芽，还与配制培养基时所使用的溶解水有关。分别用纯净水[1]、蒸馏水[2]和自来水[3作溶解剂]制成三种不同的培养基来进行石斛兰的组织培养。经过对照后发现，在培养基其他成分相同的前提下，这三种配方中配方[1]（纯净水作溶解剂）最容易促进石斛原球茎的增殖和发芽。而配方[3]（自来水作溶解剂）在接种后污染严重，40个原球茎中4个污染，污染率为10%。大约2周后有6个原球茎发生褐变，褐变率为15%。

参考文献

[1]陈永勤 《石斛兰快速无性繁殖的研究》 贵州农业科学 1994（2）：1-4

[2]中国医学科学院药物研究所等 中药志 第四册 第二版 北京 人民卫生出版社 1988：230

[3]周华建 李世君 钱秀江 龚鸿飞 《组织培养中若干因素对石斛兰试管苗生长的影响》浙江农业大学学报 21（6）：622-624 1995

[4]王熊 《兰花快速无性繁殖的研究及花芽分化的探讨》 植物生理学报 1984 10（4）：391

[5]王熊 张菊野 连宏坤等 《素心建兰无性繁殖系的建立及其开花》 园艺学报 1988 15（3）：205

[6]王熊 陈季楚 刘桂云等 《建兰和秋兰原球茎的发生及无性系的建立》 植物生理学报1981 7（2）：203

[7]中国科学院植物研究所 1976 中国高等植物图鉴

[8]Sagawa,Y.and Shoji,7.Clonal Propagation of Dendrobiums though Shoot Meristem Culfure.Amer.Orchid Soc.Bull.1967,(36):856-859

[9]Kim,K.K.,Kunisaki,J.T.,and Sagawa,Y.Shoof-tip Culture of Dendrobium.Amer.Orchid Soc.Bull.1970,(39):1077-1080

[10]Vacin,E and Went,F.Some Ph Changes in nutrient Solutions Bot.Gaz.1949,(110):605-613