双龙方与自体骨髓单个核细胞经心导管移植

李连达简历

李连达1934年出生于辽宁省沈阳市，1956年从北京医科大学医疗系毕业后，即分配到中国中医研究院西苑医院从事医疗、科研、教学工作。在长达47年的工作中，共发表学术论文230篇，主编及参加专著编写17部，获得国家科技进步奖、卫生部科技进步甲级奖以及各级科技成果奖20项。先后完成70种中药新药的研制或药理学研究工作，获得新药证书者18种。培养硕士、博士及博士后研究生多名，曾多次到美国、日本、德国及中国台湾省、香港等地作专题学术报告。鉴于其在中药研究及新药开发方面的贡献， 1999 年获中国科学技术发展奖中药奖。2003年当选为中国工程院院士。

现任中国中医研究院首席研究员、国家科学技术奖励评审委员会委员、国家新药及保健食品审评委员会委员、国家药典委员会委员及多种学术团体、杂志的理事、编委等。第七届北京市人大代表，第八、九、十届全国政协委员。

李连达院士在长期的科研医疗工作中，在推进中药药理学的学科发展与科技进步方面取得了显著成就。他在“自体骨髓干细胞经心导管移植治疗冠心病的研究”中，首次将中药与干细胞移植合用治疗冠心病，优势互补，显著提高了疗效及干细胞移植成功率，为冠心病治疗开拓了新领域，解决了医学界心肌细胞不能再生的难题。在“血瘀证与活血化瘀研究”领域，他研制30种活血化瘀新药，提高了中药研究及新药研制水平，使活血化瘀成为我国中医治疗冠心病的主流治法，在国内外产生了重大影响。尤其是70年代以来，他不遗余力地推动中药药理学学科的发展，建立了一些新的动物模型与实验方法，于1990 年创建中药药效学评价标准及技术规范，得到学术界的公认，并成为国家标准，为继承发扬中医药学，促进中西医结合事业的发展，推进中医药学现代化及中医事业的发展做出了巨大的贡献。

评价干细胞移植对冠心病的疗效的实验研究，必须有一个可靠的动物模型和合理的移植方法。目前常用的心肌缺血损伤模型为结扎冠状动脉，在一定程度上可以模拟心肌缺血，但毕竟与冠心病的病理状态不同。常用的移植方法是将干细胞直接注射到受损的心肌，或通过心导管利用螺旋注射器经心内膜将干细胞多点注射到缺血心肌，注射移植往往不可避免带来心肌的二次损伤，同时又需要开胸等复杂手术，操作繁琐。在动物模型与移植方法上都需做相应的改进。

我们在成功建立了中国小型猪心导管送入栓子形成心肌梗死动物模型的基础上，又进行了新的移植方法研究，建立了心导管介入将自体骨髓单个核细胞（bone merrow mononuclear cells，BM-MNCs）定位植入冠状动脉的新方法，效果确切，便于临床推广应用。双龙方是由人参、丹参制成的中药复方制剂，具有“益气养血、活血通脉”功能，主治“胸痹”（气虚血瘀型），适用于冠心病（心绞痛、心肌梗死）。本研究考察双龙方与BM-MNCs对中国小型猪心肌梗死的影响。

材料与方法

1材料

1.1 动物

小国小型猪，39只，购自中国农业大学，雄性，体重18～22kg。

1.2 仪器与器材

C型臂X光机：MAXIMUSCM80，PHILIPS公司。

超声心动图机：DPI5000，PHILIPS公司。心电监护：Cardio Serv,GE公司。心导管介入器械：7F指引导管（7F Guiding Catheter）7F鞘管（7F Dilator,0.038inch DDJ G.W.）、球囊导管（PTCA Dilatation Catheter）、0.014英寸导丝（0.014 inch Guide Wire）等，Cordis Corporation,USA。荧光显微镜，德国Leica公司。倒置相差显微镜及显微照相系统，Olympus公司。数码相机，日本Nikon公司。扫描仪，S2E5100U,Acer公司。多媒体彩色病理图像分析系统：MPIAS－500型，北京。高速离心机：BECKMAN－15R，美国。超净工作台：SW－CJ－IF，苏州净化仪器厂。冰冻病理切片，Leica公司。

1.3 试剂与药品

羟乙基淀粉，B.Braun Medical Inc.,Irvine,CA,USA.DMEM培养基，Gibco公司。胎牛血清，Gibco公司。PKH2－GL（PKH2 Green Fluorescent Cell Linker）,Sigma公司。硝基四氮唑蓝（N-BT），军事医学科学院药材供应站。肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，北京中生生物工程高技术公司。血浆内皮素（ET）、血栓素B2（TXB2）及6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）放免试剂盒均购于北京福瑞生物工程公司。盐酸地尔硫艹片，天津田边制药有限公司，批号：0003003。人参、丹参，购自同仁堂中药厂。

1.4 双龙方制备方法

双龙方由人参、丹参等组成。按原方剂的比例称取生药、浸泡、水煎取汁，真空干燥成粉备用，每克干浸膏相当于原生药5g。

2方法

2.1 动物分组

分7组：A组为模型对照组（n=7）；B组为盐酸地尔硫艹组（5mg・kg-1・d-1，n=5）；C组为双龙方小剂量（0.25g・kg-1・d-1，n=6）；D组为双龙方中剂量（0.5mg・kg-1・d-1，n=5）；E组为双龙方大剂量（1g・kg-1・d-1，n=6）；F组为M-MNCs移植组（n=5）；G组为BM-MNCs移植+双龙方组（n=5），进行BM-MNCs移植同时给予双龙方0.25g・kg-1・d-1，双龙方及盐酸地尔硫艹均为po给药，qd，共给药14d。

2.2 心导管介入心肌梗死造模方法

戊巴比妥钠(20mg・kg-1)耳静脉注射麻醉，接心电监护。分离颈总动脉，动脉穿刺插入鞘管，给肝素200u・kg-1抗凝，给利多卡因（5mg・kg-1）以预防室颤。左前斜位在C型臂X光机透视下将右冠导管插入至主动脉升段，通过泛影葡胺造影定位使导管开口与冠状动脉开口同轴，将导丝小心插入冠状动脉左前降支，再通过球囊送入栓子至左前降支中下1/3处。造影确认阻断血流后，依次退出导丝、球囊、导管及鞘管。

2.3 BM-MNCs分离方法

实验动物备皮消毒，将一次性注射器及穿刺针肝素化，于两侧髂后上嵴抽取骨髓8ml，在超净工作台内，向骨髓液内加入6%羟乙基淀粉2ml（按4：1比例），充分混匀后，静置40min，使红细胞沉淀。小心吸取单个核细胞所在的细胞层，400g（2500r・min-1）离心10min，将获取的细胞再用DMEM培养基洗3次，备移植用。

2.4 BM-MNCs标记方法

移植前按照PKH2-GL染液标记方法进行绿色荧光标记。

2.5 BM-MNCs经心导管移植方法

在球囊远端打3个直径为0.5mm的等距圆孔，并将球囊管道内外肝素化。导丝进入冠状动脉左前降支，以导丝为轨道送入球囊，到达冠状动脉左前降支中段后，将标记过的BM-MNCs经球囊输注入冠状动脉左前降支中下段及各分支，2～3min将细胞输注完毕，再用少量培养基冲洗球囊内残留的细胞，然后小心退出球囊。其余各组则输注等量DMEM培养基。

2.6 观测指标

2.6.1 心电图于手术前、栓塞后30min分别做标准肢体导联及胸前导联心电图。

2.6.2 冠状动脉左前降支造影动物处死后，立即取下心脏，用肝素磷酸盐缓冲液灌流冠状动脉系统后，用76%泛影葡胺注射液进行冠状动脉左前降支造影，以观察冠状动脉栓塞情况及侧枝循环情况。

2.6.3心肌梗死范围测定采用硝基四氮唑蓝（N-BT）染色法，取出心脏，观察冠状动脉系统、栓子位置、梗死区域变化。从栓子栓塞冠状动脉部位至心尖将心室平行等厚度切为5片，N-BT染色，将每片心肌两切面分别扫描（真彩模式，200dpi），用计算机图像分析仪计算梗死区面积占左心室肌面积百分比（梗死区面积/左心室肌面积×100%）和梗死区面积占全心面积百分比（梗死区面积/全心面积×100%）。

2.6.4超声心动图于d14行超声心动图检查，包括射血分数（EF）、短轴缩短分数（FS）、每搏输出量（SV）、心输出量（CO）等20余项指标。

2.6.5 心肌酶及生化指标分别于术前、术后d1、d2及d14取血，按试剂盒说明书测定CK，LDH，TXB2，6-keto-PGF1α和ET。

2.6.6心肌病理学观察取梗死区及交界区心肌，立即冰冻切片，用荧光显微镜及相差显微镜下观测BM-MNCs在心肌中及小血管上的生存、分化及扩增等情况。另取梗死区及交界区心肌，经10%甲醛固定液固定、石蜡包埋、5μm病理切片、HE染色后，观察心肌损伤、移植区内心肌细胞新生情况及心肌小血管密度（计数10个200倍视野下的血管数）等。

3 统计学方法

应用SPSS11.0统计专用软件，采用One-Way ANOVA统计方法。

结 果

1 心脏外观

缺血区心肌呈苍白色或浅黄色，在冠状动脉左前降支中下段可看到稍稍隆起的栓子。F和G组在梗死区与周边心肌的交界区，有大量肉眼可见的红色血管，并一直延伸到梗死区，这些侧枝循环血管有助于恢复缺血区心肌的供血。G组有1例心脏栓子以下心肌颜色与正常心肌区已无明显差异，无明显的苍白色或浅黄色区域，说明心肌被很好地修复。而A，B，C，D，E组的心肌修复不明显。

2冠状动脉左前降支造影

各组栓子皆完全阻断血流，F和G组在栓子以下区域可见侧枝血管进入交界区及梗死区，而其余各组不明显。

3 对心肌梗死范围的影响

梗死部位主要累及左心室前壁、室间隔前1／3，亦可累及少量右室心肌，这与冠状动脉左前降支中下段所支配的心肌区域相关。D，E，F和G组心肌梗死范围明显减小，与A组相比，差异有显著性；并且G组优于单用双龙方的C组，差异有显著性。

4 超声心动图各项指标比较

EF与FS在各治疗组皆优于A组，SV在B，D，F和G优于A组。CO在D，F和G组显著优于A组。A组表现为室间隔及左室前壁变薄，运动度下降，而F和G组室间隔及室壁变薄不明显，室壁运动趋于正常。

5 对心肌小血管密度的影响

D，E，F和G组心肌小血管密度明显增加，与A组比较有显著性差异。

6对心肌酶及生化指标的影响

为反映实验前后指标的变化情况，各项指标皆计算变化率，即（实验后／实验前）×100%，实验前皆按100％计算。对于CK的影响，G组术后d1变化率低于A组，B和E组变化率术后d14低于A组，差异有显著性。对于LDH的影响，B，C，D，E，F，G与A组比较差异均无显著性。对ET的影响，术后d1和d2时C，D，E，F，G组变化率皆明显低于A组，差异有极显著性；术后d14时，B，C，G组变化率低于A组，差异有显著性或极显著性。对6-keto-PGF1α的影响，术后d1时B组高于A组，差异有极显著性。对于TXB2影响，术后d1时G组变化率低于A组，术后d14时D和E组变化率低于A组，差异有显著性。

7 移植区内BM-MNCs观察

BM-MNCs移植前经PKH2-GL绿色荧光标记，在荧光显微镜下可以看到BM-MNCs有亮绿色荧光。梗死区及交界区的心肌冰冻切片，用荧光显微镜观察F和G组，在梗死区与正常心肌的交界区，可以看到大量亮绿色阳性染色的单个核细胞存在，其排列与心肌起行一致；同一视野用相差显微镜观察，为移植的BM-MNCs；而A，B，C，D和E组未见阳性标记的细胞存在。结合光镜下心肌小血管密度增加，说明移植的BM-MNCs在心肌中得以生存、分化、扩增，补充了因坏死而减少的心肌细胞，部分分化为心肌小血管。

讨论

本实验结果证明，双龙方对中国小型猪心肌梗死有明显治疗作用，可减小心肌梗死范围，减轻心肌损伤程度，改善心血管功能，增加心肌小血管密度，增加心肌供血。双龙方可减少心肌细胞的损伤及死亡，但单用双龙方未见有诱导心肌细胞新生的作用。当以双龙方与BM-MNCs移植合用时，则可促进移植细胞在心肌的生存、分化、扩增，产生大量新生的心肌细胞及心肌小血管，促进病变的修复，发挥协同增效、优势互补作用。

本研究进一步证实BM-MNCs经心导管移植，对心肌梗死有明显的治疗作用。可以明显减小梗死面积，改善心功能。在心脏的梗死区与缺血区可见大量侧枝循环建立，冠状动脉造影亦显示有侧枝循环血管进入梗死区。心肌缺血区可见大量荧光标记的移植的BM-MNCs，并分化成心肌细胞以修复坏死缺损的心肌；同时分化成血管内皮细胞而形成心肌小血管；移植细胞在生长过程中分泌的生长因子，会刺激血管新生，在缺血区有大量新生的小血管，这有助于恢复心肌的供血。双龙方与BM-MNCs移植联合应用，两者协同增效，共同发挥治疗作用，促进移植细胞的生长与分化，减小梗死面积、促进心功能的恢复。