CDC6基因G1321A多态性与肝细胞肝癌遗传易感性关联研究

[摘要] 目的 探讨细胞分裂周期蛋白6基因（CDC6）的G1321A（rs13706）位点多态性在中国广西人群中与肝细胞肝癌（hepatecellular carcinoma，HCC）易感性的关系。 方法 采用病例-对照研究方法，对580例HCC患者和667例对照者，运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性实验分析CDC6基因rs13706位点多态性，并应用Logistic回归模型分析该位点多态性与肝细胞肝癌遗传易感性的关系。 结果 携带AA基因型的个体较携带GG基因型的个体患HCC的风险显著降低[Odd ratio（OR） = 0.474，95% confidence interval（95%CI） = 0.315～0.714，P = 0.000 9]，并在分层分析中发现rs13706位点与HBV感染因素存在显著的交互作用（Phomogeneity = 0.033）。 结论 CDC6基因rs13706位点可能与中国广西人群HCC发生相关。

[关键词] CDC6；多态性；单核苷酸；肝细胞肝癌；rs13706

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）02（b）-0011-03

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在世界范围内最常见的癌症中排名第五，并且在癌症导致的死亡的疾病中排名第三，已经成为全球性的健康问题[1]。现在，每年肝癌患者的数量都会增加500 000，平均每年的发病率都在3%～4%[2]。在发展中国家，大多数肝癌患者由于缺乏有效的治疗，其预后不佳，并且5年存活率也比较低。HCC发病过程是由多种因素影响的，并且是多阶段的一种复杂的疾病。众所周知，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）或丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的感染是导致HCC发病的重要的风险因素，但在乙型肝炎患者或丙型肝炎患者中，只有一小部分个体最终罹患肝癌[3]。因此，人们对肝癌发生的确切机制还未知晓，我们需要对肝癌发生的风险因素做进一步的阐释。细胞分裂周期蛋白6（CDC6）最初被发现是作为DNA复制复合物前体的重要组成部分，并在DNA复制的起始阶段发挥重要的作用[4]。有研究发现CDC6与细胞周期检验点的激活有关，可以避免DNA复制的不完整性[5]，还有证据表明CDC6与细胞凋亡的进程有关[6]。在一些肿瘤诸如宫颈癌、肺癌和脑癌中都发现有CDC6蛋白的过表达[7-9]。CDC6作为一种多功能分子开关在肿瘤的发生过程中发挥了重要的作用[10]。目前CDC6基因G1321A（rs13706）多态位点在中国人群中与肝癌易感性的关系鲜有报道，因此，本研究采用病例-对照研究来阐释这个问题。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次病例-对照研究包括580例HCC患者和667例对照者。病例来自于2005年5月～2011年7月在广西壮族自治区肿瘤医院收治的确诊新发HCC患者，HCC的确诊主要通过病理学检查或临床免疫学检验甲胎蛋白（AFP）>400 μg/L且经过磁共振成像和计算机扫描成像判断。667例对照个体为在同一时间段内，来该医院进行健康体检的个体，并且没有肝癌及其他癌症的患病情况。所有研究对象无直系亲属关系。在病例及对照招募过程中，通过问卷调查的方式收集每位入选者的个人信息包括人口学资料等情况。所有研究对象均填写了知情同意书。

1.2 基因型分析

采用多聚酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法分析rs13706位点的基因型，上下游引物分别是5′-CTTCTGAGCCTCTGATTCCC-3′和5′-TCCATCCCAACTTACCTTCC-3′。每个PCR反应体系混合物为20 μL（Gene Amp PCR System 9700，Applied Biosystem，USA），包括：2 mM MgCl2，0.1 mM dNTPs，20 ng DNA，0.25 μM上游引物和0.25 μM下游引物，0.5 U Taq酶（Promega，Madison，WI，USA）。反应条件：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环。PCR反应产物经TasI （MBI Fermentas，Hanover，MD，USA）酶切，酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分型，A等位产生148 bp和61 bp 2个片段，G等位产生209 bp的片段。随机抽取10%的样本进行测序验证，验证结果显示PCR-RFLP的分型准确率达到100%。

1.3 统计学分析

Hardy-Weinberg 平衡的检验是基于在线软件SNPstats （http：// /SNPstats）进行的。使用Pearson's χ2检验来检测病例组和对照组间人口统计学变量和风险因素变量的差异。通过校正性别、年龄和HBV感染因素，采用非条件Logistic回归分析进行rs13706位点多态性和HCC易感性的关联分析。P < 0.05定义为差异具有统计学意义，所有统计学检验均为双侧检验。统计分析使用软件为SPSS软件（13.0版本，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）。

2 结果

2.1 病例-对照人群的社会人口学和临床特征

入选样本的社会人口学资料和临床特征见表1。HCC患者组平均年龄为（51.3±12.2）岁，对照组平均年龄为（49.7±11.0）岁。HCC病例组和对照组比较，性别、年龄和HBV感染情况分布差异无统计学意义（P值分别为0.088、0.334、0.949）。

2.2 CDC6基因多态性位点rs13706与HCC患病风险的相关性

rs13706位点的基因型频率分布在对照组中符合Hardy-Weinberg平衡（P = 0.15），说明入选人群具有群体代表性。通过校正性别、年龄、HBV感染情况这些因素，经多因素Logsitic回归分析，发现基因型为AA纯合子的个体会显著降低罹患HCC的风险（OR = 0.474，95%CI = 0.315～0.714，P = 0.000 9，表2）。为了进一步研究rs13706与HCC患病风险的相关性，笔者又进行了分层分析，发现在共显性遗传模式下，rs13706与HBV感染因素存在显著的交互作用（Phomogeneity = 0.033），而与性别（Phomogeneity = 0.170）和年龄（Phomogeneity = 0.760）没有显著的交互作用（表3）。

注：OR：比值比；CI：可信区间；P值和OR值的计算采用非条件Logistic回归分析，同时校正性别、年龄、HBV感染情况

3 讨论

本研究采用病例-对照研究首次在中国广西人群中阐述了CDC6基因多态位点rs13706与HCC遗传易感性之间的关联。结果发现基因型为AA的个体较携带GG基因型的个体显著降低HCC的发生风险，并且本研究还发现多态位点rs13706与HBV感染因素存在显著的交互作用。

众所周知，细胞分裂周期蛋白6（CDC6）在DNA复制和肿瘤形成过程中发挥了重要的作用。CDC6是细胞周期调控因子之一，以同源二聚体形式存在，与双链DNA结合。在G0期，CDC6水解ATP使CDC10依赖转录因子1（Cdtl）一微小染色体维持蛋白（MCM）分离，随后MCM配对结合形成复制前复合物，从而DNA复制启动。在S期绝大多数CDC6被磷酸化而开始离开染色质，除一部分继续留在染色质上，其余转移到胞质中或被降解，避免启动子在同一个细胞周期中再次激活，保证一次细胞周期的完整性[9]。在正常的细胞中，CDC6只在细胞增殖时出现，而在静止期细胞中检测不到CDC6的存在。有研究表明在p53缺乏的细胞中CDC6过表达可以导致DNA的再复制[11]。因此，CDC6表达的增加或激活可以引起致癌基因的扩增，并通过延长S期使DNA过度复制来引起癌症的发生[9，11-12]。

通过研究可以发现rs13706位点与HBV感染因素存在显著的交互作用，因此更能说明HBV感染是HCC发生的重要风险因素。而在分析中，男性中携带AA基因型的个体可以显著降低HCC的发生风险（OR = 0.446，95%CI = 0.284～0.700，P = 0.000 6），但是rs13706位点与性别没有显著的交互作用，同时可以发现在病例组和对照组中女性个体的数量都比较少，这有可能影响分析的结果。因此，需要更大样本量的研究来验证在女性人群中rs13706与HCC易感性之间的关联。

本研究是基于医院的病例-对照研究，患者和健康对照者的收集都是来自同一家机构，可能不能代表整个中国人群。

本研究初步表明，CDC6基因rs13706位点多态性与中国广西人群HCC发生有明显相关性，结果提示遗传因素在HCC发生中起了一定作用，并为以后HCC的基因诊断及治疗提供参考依据。

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（收稿日期：2012-10-22 本文编辑：林利利）