树突状细胞/肿瘤细胞融合诱导的抗肺癌CTL作用的初步究

【摘要】 目的 探讨人源树突状细胞/肿瘤细胞融合诱导的抗肺癌CTL作用。方法 培养体系中加入rhGM CSFrhIL 4rhTNF α等细胞因子诱导人骨髓来源树突状细胞,并与原代培养的人肺癌细胞融合;以融合细胞诱导外周血产生CTL并测定其细胞毒性。 结果 骨髓单个核细胞在rhGM CSFrhIL 4rhTNF α等细胞因子存在下培养10～12 d,出现典型的成熟树突状细胞。体外诱导的人骨髓来源树突状细胞(DC)表达较高水平HLA DR、CD86。对照DC和肿瘤细胞表达相应检测的单种抗原,而融合细胞两种抗原的表达水平均较高。 DC/肺癌细胞融合在体外能有效诱导CTL产生,后者对靶细胞产生较强的细胞毒作用。结论 通过本课题的研究证实DC与肿瘤细胞融合技术制备的肿瘤疫苗代表一类更为有效的抗肿瘤免疫策略。

【关键词】 树突状细胞;细胞融合;肺癌;疫苗

树突状细胞(DC)是目前鉴定的最有效的抗原递呈细胞(APC),自1973年首次识别DC以来,对DC的研究不断深入。DC独特的形态、高表达抗原递呈分子及介导T细胞连接、共刺激的辅助分子等生物学特性决定其在免疫学中的重要作用[1]。人类肿瘤表达大量能被T细胞识别的蛋白质抗原,为癌症免疫治疗提供靶位,但大多数人类肿瘤为弱免疫源性,能逃避宿主免疫系统。抗原递呈途径的改变为肿瘤特异性抗原不能向宿主递呈的原因之一。为此改变、促进机体免疫系统对肿瘤抗原的递呈是肿瘤免疫治疗中具有实用价值的研究方向。鉴于DC在抗原递呈中的重要作用,以其为基础设计的肿瘤疫苗日益受到重视。本研究在诱导人骨髓来源树突状细胞的基础上,探讨了树突状细胞/肿瘤细胞融合特异性抗肺癌免疫研究。

1 材料和方法

1.1 骨髓 共6例,取自中日联谊医院胸外科肺癌患者手术中切下的肋骨,骨髓病理检查证实均无癌骨髓转移灶,为正常骨髓象。肺癌标本:共6例,取自上述患者手术标本,均经病理检查确诊。外周血:上述6例患者外周血。

1.2 主要试剂 IMEM培养基、胎牛血清、FITC标记抗CD86、HLA DR McAb、 PE标记抗CA 199 McAb、淋巴细胞分离液、rhGM CSF、rhIL 4、rhTNF α、 PEG 4000、3H TdR等。

1.3 人骨髓树突状细胞的诱导及鉴定 体外诱导:无菌取手术患者术中切下的肋骨,除去上面附着的软组织,用PBS冲洗,再用骨钳切为约3～4 cm长,从一端插入事先吸入培养液的注射器,冲洗骨髓腔,冲洗数次,用200目铜网过滤,淋巴细胞分离液(70%)分离单个核细胞,PBS洗两次,用15%DMEM配制成2×105/ml单细胞悬液,培养于37°,培养体系中加入人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM CSF)和白介素 4(rhIL 4)诱导骨髓单个核细胞在体外产生树突状细胞。

1.4 DC表型分析 收集培养10 d的DC与抗体CD86、HLA DR作免疫荧光染色及FACS分析。

1.5 人肺癌细胞的原代培养 选取6例中日联谊医院住院手术肺癌患者的手术标本,均经病理确诊。无菌取下肿瘤组织后,机械剪碎,用0.25%胰蛋白酶消化后5 h,收集单个细胞,DMEM洗2次,培养于15%DMEM中;经组织学染色观察肿瘤细胞形态学特征。

1.6 人骨髓DC与人肺癌细胞融合及鉴定 用50%聚乙二醇(PEC)4000 融合DC与原代培养的肺癌细胞,DC与肿瘤细胞的比例为6:1,PBS洗涤后,融合细胞培养在含15%FCS的DMEM培养液中,培养体系中含GM CSF(4ng/ml)。通过以FICT 抗HLA DR、CD86抗体标记DC,测定HLA DR、CD86表达水平。选取一株CA199阳性表达的细胞DC/肿瘤细胞融合细胞,以PE 抗CA199和FICT 抗CD86进行双标记,同时以DC和肿瘤细胞作对照,检测DC与肿瘤细胞的融合效力。

1.7 CTL的产生及细胞毒性的测定 以20,000rad剂量照射DC单独(1.7×106/鼠)、肿瘤细胞单独(B16或3LL)(3×105/鼠)、DC单独、DC与肿瘤细胞同时加入、抗原肽刺激DC、DC/肿瘤细胞融合瘤苗后,上述细胞再与同源PBMC共同培养3 d,而后与原代培养细胞共同培养5 d,掺入3H TdR18 h后,收集细胞,测定放射性核素闪烁记数值。

2 实验结果

2.1 树突状细胞的诱导 在培养的前7 d,无明显细胞集聚体出现,加入GM CSF、TNF α继续培养3～5 d,出现典型的成熟树突状细胞,见图1。

图1 人骨髓来源的树突状细胞的形态学观察(200×)

2.2 肺癌细胞的原代培养 如图2所示,6例原代培养肺癌细胞均呈上皮型,细胞形态多样,多呈多角型,核:浆比例增加,核深染。

图2原代培养肺癌细胞(瑞氏染色)

2.3 人骨髓DC/肺癌细胞融合诱导的CTL的细胞毒性 见表1。结果表明DC/肺癌细胞融合在体外能有效诱导CTL产生,后者对靶细胞产生较强的细胞毒作用;以抗原肽刺激DC或DC/肺癌细胞同时加入诱导CTL的培养体系,亦诱导出一定的CTL活性,但其对靶细胞的杀伤效力显著低于融合瘤苗诱导的CTL。

表1

人DC融合疫苗的体外诱导杀伤作用

体外诱导CTL条件杀伤率(%)(x±s,D)

E:TE:TP值

10:120:1

DMEM1.1±0.70.5±0.4

DC单独2.3±1.2 2.7±1.3

肺癌细胞单独 3.0±0.8 0.9±0.8

DC/肺癌细胞同时加入14.1±6.7** 20.8±6.9**

以抗原肽刺激DC33.1±8.3**41.6±9.7**

DC/肺癌细胞融合66.8±7.9***83.1±5.5***

*

注:**第四组、第五组分别与前三组比较;***第六组与前三组比较;*第六组与第四、第五组比较

3 讨论

DC在抗原递呈中发挥重要作用,以其为基础设计的肿瘤疫苗日益受到重视。以肿瘤抗原肽、肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞RNA等体外冲击或将TAA基因转染到DC内,均被认为是颇有前途的疫苗制备方案[2]。但这些体外冲击手段均具有半衰期短等缺点。DC与肿瘤细胞融合具有以下优点:融合细胞使天然抗原性肿瘤蛋白递呈到细胞表面的MHC 肽复合物中、在体内可产生相对稳定、持续的抗原加工和递呈、完整的肿瘤细胞与DC的融合使多种未知、未鉴定的肿瘤抗原共同参与免疫宿主。

国内外有关DC/肿瘤细胞融合疫苗的构建的相关研究主要局限在动物实验水平,如DC与肥大细胞瘤细胞[3]、肾细胞癌融合等,但在2004年后半年以来,国外此方面的报道增多,如美国的最新一篇报道中介绍了人源DC/乳腺癌、卵巢癌细胞融合疫苗的实验研究[4 6]。但到目前为止尚未见有关人源DC/自体肺癌细胞融合疫苗的报道。国内人源DC/肿瘤细胞融合疫苗的研究只是局限于正常人外周血来源DC,所应用的肿瘤细胞均为细胞系,未能为发展个体化瘤苗提供一定理论依据[7 9]。

本研究结果表明DC/肺癌细胞融合在体外对靶细胞产生较强的细胞毒作用,其CTL活性显著高于以抗原肽刺激DC或DC/肺癌细胞同时加入培养体系诱导CTL。本研究结果作为DC融合瘤苗的个体化治疗的初步探索性工作,将为其进一步广泛应用奠定实验基础。

本研究进一步证实DC与肿瘤细胞融合技术制备的肿瘤疫苗代表一类更为有效的抗肿瘤免疫策略。我们推测DC融合瘤苗在荷瘤个体肿瘤的综合治疗、预防肿瘤术后复发、转移等领域具有广阔的应用前景。

尽管有关DC融合瘤苗的研究取得一定进展,但几乎所有研究均集中在DC融合瘤苗的抗肿瘤作用及其机制等研究方面,由于DC与肿瘤抗原融合后递呈的抗原成分极其复杂,应用于机体也可能引起免疫系统其他复杂变化,因此在今后的研究中需对DC融合瘤苗的可能副作用进行深入、广泛的探讨。

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