吸附重金属镉优势菌的筛选及鉴定

摘 要：随着工农业的发展，重金属污染越来越受到人们的关注。本研究以受重金属污染的土壤及生活污水处理厂污泥为原料，从中筛选驯化出抗镉菌株各一株，编号A、B，其结果显示，A抗镉浓度可达为547.5 mg/L，B抗镉浓度可达438 mg/L。

关键词：微生物 镉 筛选 鉴定

中图分类号：X825 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）07（b）-0137-02

随着工农业的发展，采矿、冶炼、电镀等行业向环境中排放了大量的重金属离子，引起环境和生态恶化，其中镉是污染程度最严重的重金属之一。据统计，在过去半个世纪里，全球排放到环境中的镉达到22000[1]。中国受到镉污染的耕地分布在11个省市的25个地区，约为1.3万hm2。每年约有1200万t粮食因污染而损失，其中镉米就达到5万t以上，蔬菜镉超标率为11.6%[2]。重金属污染严重危害着我国粮食生产和食品安全。

重金属污染治理的方法中，传统的物理化学方法具有成本高、易产生二次污染等特点，生物法不仅可以降低处理的成本，还具有较好的经济、环境效益，以成为目前的研究热点。自然界中耐重金属微生物大量存在，往往可从受重金属污染的环境中筛选出优势菌种。

1 材料与设计

1.1 样品

样品1：采自内江市某电镀厂边缘的土壤。

样品2：采自某生活污水处理厂的活性污泥。

1.2 主要仪器

主要仪器：BT224S型电子分析天平；LRH-150F型生化培养箱；YXQ-LS-50 SLL立式压力蒸汽灭菌器；SW-CJ型超净工作台；摇床。

1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1.0 g、0.5 g NaCl、琼脂15 g、去离子水定容至100 ml，调节pH为7.2～7.4。

豆芽汁葡萄糖培养基：黄豆芽10 g、葡萄糖5 g、琼脂1.5～2.0 g，去离子水定容至100 ml，自然pH。

1.4 方法

（1）选择最适培养浓度。

称取5 g土壤鲜样加到15 ml灭菌水中，置于摇床振荡10 min。吸取悬浮液0.1 ml、无菌水0.9 ml加入无菌试管中，此时菌悬液浓度为10-1。以浓度为10-1菌悬液为基准液，采用逐步稀释法，配制浓度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液；吸取不同浓度的菌悬液各0.1 ml于相应的培养基中，涂布均匀，置于培养箱中28 ℃培养48 h后，观察培养基中微生物的生长状况，选取生长单菌落数量合适的相应浓度作为最适培养浓度。

按上述方法制备污泥悬浮液，并选取最适培养浓度[3]。

（2）菌株的分离。

取最适培养浓度悬浮液涂布于Cd（Ⅱ）浓度为43.8 mg/L的牛肉蛋白胨培养基上，至于恒温培养箱中培养，48 h后观察平板上的菌落，挑取单个菌落进行划线培养，重复三次以上，直到在显微镜下观察为纯菌[4]。

（3）菌株的驯化。

将纯化后长势最好的单菌落转接到Cd（Ⅱ）浓度为43.8 mg/L、87.6 mg/L、219 mg/L的牛肉蛋白胨培养基上，培养3 d后，选取在219 mg/L中长势最好的单菌落继续转接到Cd（Ⅱ）浓度为328.5 mg/L、438 mg/L、547.5 mg/L的牛肉蛋白胨培养基上，培养3 d。

（4）抗性菌株的鉴定。

①个体形态特征：采用革兰氏染色法染色，镜检观察其个体形态特征。

②群体形态特征：将菌株接种于牛肉蛋白胨固体培养基，28 ℃培养2 d，观察单菌落特征。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

土壤及污泥悬浮液经浓度梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6平板培养分析后，均选取浓度为10-5的悬浮液为最适培养浓度。在该浓度下培养微生物并纯化培养，从土壤中分离出抗性菌3株，编号A1、A2、A3，从活性污泥中分离出抗性菌两株，编号B1、B2。

2.2 菌株的驯化

当培养基中Cd（Ⅱ）浓度为43.8 mg/L、87.6 mg/L时，菌株A1、A2、A3均生长良好，Cd（Ⅱ）浓度继续增大，A2、A3相继被淘汰，A1表现出明显优势，仍然生长良好。Cd（Ⅱ）浓度为547.5 mg/L时，A1生长受到抑制，Cd（Ⅱ）浓度继续增大，A无法正常生长。B1、B2的驯化过程中，Cd（Ⅱ）浓度增加至219 mg/L时，B2无法正常生长，加大Cd（Ⅱ）浓度，得B1最高耐Cd（Ⅱ）浓度为438 mg/L。

2.3 菌株的鉴定

A1、B1经试验鉴定如表1所示。

由表1鉴定操作初步推断A1为革兰氏阴性短杆菌，B2为黄杆菌。

3 结论

采用微生物分离纯化技术，从受重金属污染土壤及活性污泥中各分离出对Cd（Ⅱ）具有高抗性的菌株A1、B1，A1最高耐Cd（Ⅱ）浓度在547.5 mg/L左右、B1最高耐Cd（Ⅱ）浓度在438 mg/L左右，A1菌株的耐性要高于B1菌株。经初步鉴定，A1为革兰氏阴性短杆菌，B1为黄杆菌。

通过对菌株A1、B1的形态学的观察，为菌株A1、B1的分类鉴定奠定了基础。

参考文献

[1] 孙铁珩，李培军，周启星.土壤污染形成机理与修复技术[M].北京：科学出版社，2005.

[2] 胡振琪.重金属污染土壤的粘土矿物与菌根稳定化修复技术[M].北京：地质出版社，2006.

[3] 刘彧.污泥中耐镉微生物的筛选与鉴定[D].西南大学硕士学位论文，2007

[4] 曾晓希，胡岳华，柳建设，等.中华根瘤菌NL的筛选与鉴定[J].湖北农业科学，2007（2）：30-32.

[5] 江澜.教学中革兰氏染色两种方法的比较研究[J].生物学通报，2000，35（11）：38.