胆囊癌中微淋巴管密度与HIF-1α表达的相关性

作者单位：519000 中山大学附属第五医院

通讯作者：吕宝军

【摘要】 目的 研究分析微淋巴管密度（micro-lymphatic vessel density, MLVD）和缺氧诱导因子-1α （hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）在胆囊癌组织中的表达情况及相关性。方法 用免疫组织化学方法检测胆囊癌组织MLVD和HIF-1α的表达情况，分析两者在胆囊癌组织中表达的相关性。结果 胆囊癌组织中MLVD和HIF-1α的表达明显高于在慢性胆囊炎组织中的表达，差异均有统计学意义 （t4.033和χ222.323，P

【关键词】 胆囊癌； 微淋巴管密度； 缺氧诱导因子-1α

Expression and correlation of MLVD and HIF-1α in gallbladder carcinoma XIE Xiao-ming，LV Bao-jun，GOU Xin-min，WANG Xiao-hong.The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University，Zhuhai 519000，China

【Abstract】 Objective To investigate the expression and correlation of MLVD and HIF-1α in gallbladder carcinoma.Methods MLVD and HIF-1α in 100 specimens of gallbladder carcinoma were detected by immunohistochemistry.The correlation of HIF-1α expression to MLVD was analyzed by Spearman's rank correlation.Results MLVD and HIF-1α were dramatically higher in the gallbladder carcinoma than that in the chronic cholecystitis tissues（t4.033 and χ222.323，P

【Key words】 Gallbladder carcinoma； Micro-lymphatic vessel density； Hypoxia inducible factor-1α

研究证实，D2-40是一种高度特异和高度灵敏的淋巴管标记物，它的发现促使肿瘤淋巴转移的研究成为热点［1］。近年来大量文献报道，HIF-1α是在乏氧环境下广泛存在于人体内的一种信号转录因子，它在肿瘤的发生、发展、浸润、转移和凋亡等方面起着十分重要的作用［2］。本研究通过分析MLVD和HIF-1α表达的相关性，明确HIF-1α参与肿瘤淋巴结的转移，从淋巴管生成的角度分析胆囊癌淋巴转移机制。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取中山大学附属第五医院普通外科2007年1月～2010年1月收治的，经病理组织学确诊且术后标本蜡块保存完好的胆囊腺癌病理标本47例。随机选取同期慢性胆囊炎标本25例做为对照组。胆囊癌患者年龄为36～72岁，中位年龄53.7岁；病理组织学分级：高分化腺癌15例，中分化腺癌20例，低分化腺癌12例。所有病例术前均未接受过新辅助化疗及放射治疗，并除外合并其他恶性肿瘤病例。

1.2 主要试剂 鼠抗人单克隆抗体D2-40、HIF-1α单克隆抗体、PV9000检测试剂盒、DAB显色试剂盒、生物素标记抗小鼠IgG等均购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.3 实验方法 胆囊癌组织中D2-40标记的微淋巴管密度和HIF-1α表达的测定（免疫组化Envision法）。所有标本经40 g/L甲醛溶液固定，常规脱水包埋，Envision免疫组化二步法染色。D2-40用已知阳性切片做阳性对照，HIF-1α阳性照片由中杉金桥公司提供，以PBS代替第一抗体作阴性对照。

1.4 结果判断标准 微淋巴管密度（MLVD）计数：D2-40蛋白定位于细胞质或细胞膜中，阳性表达为出现棕黄色或褐色颗粒。D2-40阳性标准以及MLVD计数参照Weidner［3］方法并加以改进，任何被染成黄色或棕黄色孤立的内皮细胞，不以能否形成管腔为计数单位，而以聚集成条裂隙状、索状或管状细胞团，并且能与附近的肿瘤细胞和（或）结缔组织分开，作为一个微淋巴管计数。高倍镜下选取4个视野内的微淋巴管数，测量窗面积为0.906 mm2，取其平均数作为该肿瘤的MLVD值，各组MLVD用均数±标准差表示。HIF-1α蛋白以细胞核内有棕黄色颗粒为阳性，仅少数胞浆着色的细胞记为阴性。首先，以阳性细胞百分率计分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。再次以染色强度分为4个等级，无染色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分，最后将两者积分乘积为0表示阴性（-），＞1为阳性，其中1～2 表示弱阳性（+），3～4表示阳性（++），≥5为强阳性（+++）。

1.5 统计学处理 使用SPSS 12.0统计软件进行数据分析。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验；MLVD与HIF-1α表达的相关性采用Spearman等级相关分析。P

2 结果

2.1 胆囊癌组织中MLVD和HIF-1α的表达 D2-40阳性表达定位于淋巴管内皮细胞，D2-40阳性的脉管从形态上看符合淋巴管的特征：单层内皮细胞构成，管壁较薄，而阴性染色的脉管即血管，其内含有红细胞。阳性染色的淋巴管在胆囊癌组织和慢性胆囊炎组织中均可见到，而在胆囊癌组织中，绝大多数淋巴管位于肿瘤间质组织内，形态不规则，管腔大小不一，管壁薄，癌细胞侵入部分淋巴管内。胆囊癌组织中MLVD和HIF-1α的表达明显高于慢性胆囊炎组织的表达，差异均有统计学意义（t4.033和χ222.323，P

表1 胆囊癌和慢性胆囊炎组织中MLVD和

HIF-1α的表达

注：两组MLVD比较，t4.033，P

2.2 胆囊癌组织中MLVD和HIF-1α表达的相关性分析 根据癌组织中HIF-1α表达的评分值与MLVD值的关系，作Spearman等级相关性分析，MLVD和HIF-1α之间密切相关（r＝0.573，P

3 讨论

近年来大量文献报道，HIF-1α是在乏氧环境下广泛存在于人体内的一种信号转录因子，它在肿瘤的发生、发展、浸润、转移和凋亡等方面起着十分重要的作用。HIF-1是由α和β两个亚基组成的异源二聚体转录激活因子，其中HIF-1α为HIF-1受氧调节的特异亚单位。肿瘤组织中HIF-1α过度表达与上调VEGF、刺激血管生成和不良预后有关。目前的研究表明，HIF-1α过度表达在膀胱移行细胞癌和大肠癌细胞的浸润、转移和肿瘤血管的生成中起重要作用，HIF-1α有望成为预测肿瘤诊断、复发以及监测肿瘤浸润、转移的一个重要指标［4］。

肿瘤的远处转移包括血道和淋巴道转移，肿瘤的淋巴道转移机制目前还不是很清楚。近年来，D2-40的发现得到了一种高度特异和敏感的淋巴管内皮细胞标记物，从而促使淋巴管生成和肿瘤转移之间的关系成为目前研究的热点之一。研究证实，D2-40分子量为40KD，是一种单克隆抗体，能够特异性地结合唾液酸糖蛋白（M2A），而M2A仅仅存在于淋巴管内皮细胞，D2-40对淋巴管内皮细胞的标记具有很高的特异性和敏感性，D2-40可以广泛应用于肿瘤组织淋巴管的研究［5］。

最近，王亚秋等［6］研究表明，甲状腺状癌中HIF-1α调节VEGF-C（vas- cular endothelial growth factor-C，血管内皮生长因子）的表达，共同参与了淋巴结转移的过程。VEGF-C又称淋巴管生成因子。近年来许多学者的同类实验都说明了HIF-1α的表达与肿瘤淋巴道的转移可能存在着一定的联系。本实验利用特异性淋巴管内皮细胞标记物D2-40，应用免疫组织化学方法进行胆囊癌组织MLVD的测定，以及胆囊癌中HIF-1α表达情况的研究，分析MLVD和HIF-1α表达的相关性，明确HIF-1α参与肿瘤淋巴结的转移，从淋巴管生成的角度探讨胆囊癌淋巴道转移机制，完善和补充了肿瘤浸润转移的理论，为寻求抗肿瘤治疗的可能途径提供实验依据和新思路。

本文通过免疫组化的方法，初步分析了胆囊癌组织MLVD和HIF-1α表达的相关性。结果表明，MLVD和HIF-1α在胆囊癌组织中高表达，MLVD和HIF-1α在胆囊癌组织中的表达具有正相关性。说明胆囊癌组织中HIF-1α促进了MLVD的高表达，提示HIF-1α参与了胆囊癌淋巴管的形成以及肿瘤细胞的淋巴转移，其具体机制尚待进一步研究。

参 考 文 献

［1］ 李锡清, 刘陶文.D2-40在肿瘤淋巴管转移中研究进展. 华夏医学, 2010, 23（2）:204-208.

［2］ 赵小祺, 王春光, 张静.缺氧诱导因子-1研究进展. 河北北方学院学报:医学版，2009，26（5）:73-75.

［3］ Weidner N, Folkman J, Pozza F,et al. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma.J Natl Cancer Inst,1992, 84（24）:1875-1887.

［4］ Koh MY, Spivak-Kroizman TR, Powis G. HIF-1alpha and cancer therapy.Recent Results Cancer Res,2010,180:15-34.

［5］ Kahn HJ,Bailey D,Marks A.Monoclonal antibody D2-40,a new marker of lymphatic endothelium,reacts with Kaposi's sarcoma and a subset of angiosarcomas.Mod Pathol,2002, 15（4）:434-440.

［6］ 王亚秋,华清泉.甲状腺状癌中缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子及血管内皮生长因子-C表达的临床意义.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2007,21（5）:204-207.

（收稿日期：2011-08-23）