莪术醋制对大鼠胆汁代谢的影响

[摘要]通过考察莪术醋制前后对由肝脏分泌的胆汁中内源性代谢产物的影响，以期探讨莪术醋制对胆汁内源性代谢物的影响。分别制备生、醋莪术醇提液及生理盐水溶液，灌胃给药05 h后做胆总管插管引流术收集12 h内大鼠胆汁；胆汁样品1∶3乙腈沉淀蛋白后进行UPLCTOFMS分析；采用单维统计与多元统计相结合，PeakView软件与网络数据库相比对的数据分析方法，鉴定潜在生物标记物。 醋制前后莪术提取物对大鼠胆汁代谢谱具显著影响，鉴别出生、醋莪术给药组的大鼠胆汁中具有显著性差异的13个代谢物；再结合化合物网络数据库进行鉴定，得到8个代谢物；进一步把给药组与空白组进行t检验单维统计分析，得到与空白组比较具显著性差异的7个代谢物，推定此7个代谢物为生、醋莪术给药后大鼠胆汁的潜在生物标记物，其中6个潜在生物标记物在醋品组中显示上调，其与磷脂代谢、脂肪代谢、胆汁酸代谢及与调控N酰基乙醇胺水解反应平衡作用相关的代谢调控相关，提示通过大鼠胆汁内源性代谢物的差异探讨莪术醋制增效的机制。

[关键词]莪术；醋制；胆汁；代谢组学；UPLCTOFMS

[Abstract]To explore the effect of vinegarprocessed Curcumae Rhizoma on endogenous metabolites in bile by investigating the endogenous metabolites difference in bile before and after Curcumae Rhizoma was processed with vinegar Alcohol extracts of crude and vinegarprocessed Curcumae Rhizoma， as well as normal saline were prepared respectively， which were then given to the rats by intragastric administration for 05 h Then common bile duct intubation drainage was conducted to collect 12 h bile of the rats UPLCTOFMS analysis of bile samples was applied after 1∶3 acetonitrile protein precipitation； unidimensional statistics were combined with multivariate statistics and PeakView software was compared with network database to identify the potential biomarkers Vinegarprocessed Curcumae Rhizoma extracts had significant effects on metabolites spectrum in bile of the rats With the boundaries of P

[Key words]Curcumae Rhizoma； vinegarprocessing； bile； metabolism； UPLCTOFMS

doi：10.4268/cjcmm20160726

中药莪术为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val，广西莪术C kwangsiensis SG Lee et CFLiang或温郁金C wenyujin YHChen et CLing的干燥根茎，莪术生品行气消积力强，醋制后主入肝经血分，增强散瘀止痛作用。历版《中国药典》一部莪术炮制项下均收载醋莪术，莪术临床方剂及中成药均以醋莪术入药，2010年版《中国药典》收载了15种以醋制莪术入药的成方制剂，其方解均注明莪术醋制后重入肝经。

莪术中主要含有挥发油、姜黄素类、微量元素及多糖等成分，其中挥发油类和姜黄素类是其有效成分群。挥发油在莪术中的质量分数约为1%～25%，为多种单萜类及倍半萜类化合物，其中主要生物活性成分为莪术醇（curcumol）、莪术二酮（curdione）、吉马酮（germaerone）、β榄香烯（βelemene）和新姜黄二酮。姜黄素类化合物是莪术中的另一类重要成分，主要指二苯基庚烃类化合物，目前已分离并鉴定20多个姜黄素类化合物，其中以姜黄素（curcumin）、去甲氧基姜黄素（demethoxycurcumin）和双去甲氧基姜黄素（bisdemethoxycurcumin）为主要活性成分[1]。

莪术具有较强行气破血、活血化瘀之功，在抗纤维组织增生、抗肿瘤、抗血栓、抗菌抗病毒、抗炎等方面均有显著功效。由莪术和红花制成的静脉注射剂莪红注射液可治疗缺血性心血管病[2]，莪术油葡萄糖注射液是1995年版《中国药典》二部新收载的抗病毒药。莪术中抗癌有效成分β榄香烯已被制成注射液使用。研究表明，莪术中主要的抗癌活性成分为姜黄素、β榄香烯、γ榄香烯、莪术醇、莪术酮、吉马酮、异莪术烯醇等[3]，其均来源于莪术挥发油类及姜黄素类成分。

代谢组学最早由Nicholson等[4]提出，其关注于对限定条件下的特定生物样品中所有内源性代谢产物的定性定量分析，并指示生物体对内源或外源刺激的代谢应答。将系统论指导下的代谢组学与中医药学的整体观念相结合，可以使中医药学由经验描述式的科学逐步转变成定量描述和预测的科学，所以在中药现代化研究中代谢组学已逐步应用于中药归经研究、中药安全性评价、中药复方研究等多个领域中。

胆汁为肝脏分泌的液体，主要参与脂肪的消化和吸收并将某些代谢产物从肝脏中排出；且肝与胆的关系很密切，病理上相互影响，治疗上往往是肝胆同治。中医理论认为，胆位于肝内，胆汁乃肝经之余气而成，两者一脏一腑表里相属，有络脉相连其经脉，皆行于胁肋。《灵枢・本脏》说：“肝合胆”。课题组经前期研究发现，莪术醋制后可以促进大鼠的胆汁分泌，其胆汁排泄总量与生莪术组相比具有显著性差异，本文以胆汁为研究对象，从代谢的角度研究药物对肝脏系统的扰动，采用超高效液相色谱飞行时间质谱（UPLCTOFMS）分析技术及统计学分析方法，研究生、醋莪术药物作用后对胆汁中代谢物组的扰动，挖掘潜在的生物标记物，探索现代新技术在传统中药炮制理论研究中的应用。从胆汁代谢组学的视角探讨醋制对中药莪术的影响未见报道。

1材料

Ekspert ultraLC 100XL超高效液相系统，包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱；AB Sciex TripleTOF 5600飞行时间质谱仪（美国AB Sciex公司），配有Analyst TF16工作站、PeakView分析软件、MarkerView分析软件等；FA1104型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；LDZ52型全自动离心机（北京医用离心机厂）；KQ500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；MilliQ Gradient A10 超纯水器 （Millipore，Bedford，MA，USA）；旋转蒸发仪（瑞士Buchi）；涡旋振荡混合器（上海沪西分析仪器厂）。

甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯；莪术，购自浙江，批号20120506，经南京中医药大学药学院巢建国教授鉴定为温郁金Cwenyujin的干燥根茎。

SPF级健康SD大鼠，雄性，体重280～320 g，由南京中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（浙）20080033，实验前于南京中医药大学实验动物中心适应饲养1周，以适应本实验室环境，给予标准光照周期（14 h光照、10 h黑夜），实验室温度维持20～25 ℃，相对湿度控制在70%左右。

2方法

21样品制备

211生莪术及醋莪术的制备按照《中国药典》莪术炮制项下规定进行制备生、醋莪术饮片。生莪术：取净莪术，略泡，洗净，蒸软，切厚片，干燥制得生莪术饮片。醋莪术：取净莪术加醋煮至透心，取出，稍凉，切厚片，干燥制得醋莪术饮片。

212生莪术及醋莪术提取液的制备中药水提液中以多糖类物质为主，而本文研究对象为莪术中活性成分挥发油类和姜黄素类，其均为脂溶性成分，故采取醇提法进行提取，具体提取方法如下：取适量生莪术或醋莪术，粉碎后提取3次，用15倍量的90%乙醇加热回流1 h，药渣再加6倍量60%乙醇加热回流1 h，药渣继续加6倍量40%乙醇加热回流1 h，合并以上3次提取液，过滤后40 ℃减压浓缩使得生药量提取液终浓度为14 g・mL-l，4 ℃保存。

22分组与给药

实验分成空白组（Control）、生莪术组（RRC）、醋莪术组（VRC），每组5只，实验开始前12 h禁食，自由饮水。生、醋莪术组分别灌胃给予生、醋莪术药液1417 g・kg-1，空白组灌胃等量的生理盐水溶液。

23大鼠胆汁采集

于给药05 h后腹腔注射10%水合氯醛（3 mL・kg-1）麻醉后，迅速打开腹腔，仰位固定，做胆总管插管引流术，并以生理盐水纱布覆盖腹部。插管成功后，收集12 h内大鼠胆汁，-80 ℃冰箱保存备用。

24大鼠胆汁前处理

取各胆汁样品1 mL，加3倍量乙腈，涡旋3 min，12 000 r・min-1离心10 min，取上清液35 ℃氮气吹干，残渣以10 μL甲醇复溶，再次12 000 r・min-1离心，取上清液。

25UPLCTOFMS分析

251色谱条件Agilent Zorbax SBC18色谱柱（21 mm×50 mm，18 μm）；流动相乙腈（A）01%甲酸水（B），梯度洗脱，0～5 min，5%～35%A，5～10 min，35%～50%A，10～20 min，50%～65%A，20～25 min，65%～100%A，25～28 min，100%A，流速04 mL・min-1，进样量2 μL，柱温30 ℃，运行30 min。

252TOFMS质谱条件采用ESI离子源，正离子模式下采集信号。DuoSpray离子源，源参数设置如下：喷雾电压（ion voltage）5 500 V，解簇电压（declustering potential）60 V，离子源温度（sorce temperature）550 ℃，气帘气（curtain gas）35 Pa，Gas1（nebulizer gas）55 Pa，Gas2（heater gas）65 Pa；采用MS/MS二级质谱扫描模式，质量数扫描范围m/z 100～1 000；动态背景扣除。

253数据分析样品UPLCTOFMS图谱及数据导入MarkerView软件进行PCA多元统计分析并进行t检验单维统计分析得到差异代谢产物，进而采用AB Sciex的PeakView软件对差异代谢产物的色谱峰进行识别和峰匹配，对照标准谱图鉴定潜在生物标记物种类，最后与空白组进行t检验单维统计分析排除掉给药前后不发生显著变化的代谢物，最终确认潜在生物标记物。

3结果

31胆汁样品UPLCTOFMS总离子流图

各组大鼠的胆汁样品UPLCTOFMS总离子流图见图1。经直观分析，各组大鼠胆汁代谢物谱有明显的不同。在本实验条件下，22～26 min有大量的物质被洗脱出，生、醋莪术代谢物谱的组间差异还需进一步分析。

32主成分分析

为了使样本的分析结果更加直观，首先采用主成分分析进行LCMS复杂数据的降维处理，以便直观区分各组样本差异。将空白组、生莪术组和醋莪术组胆汁代谢物的UPLCTOFMS原始图谱及数据导入MarkerView软件进行主成分分析（PCA分析）并进行降维处理，绘制反映组间离散程度的Score Scatter Plot散点图见图2，任一点表示一个对应的样本，可以发现给药组与空白组间的代谢轮廓呈分离趋势，提示给药组与空白组的代谢谱存在组间差异；从图2中看出，醋品组，同时生、醋莪术组之间的代谢轮廓也呈分离趋势，提示2组代谢物谱存在差异。

33生、醋莪术胆汁代谢物组间差异代谢物的探寻

生物标记物是能够代表性反映生物体的生理病理变化或外界环境刺激的内源性物质。为了进一步明确生、醋莪术胆汁代谢物的组间差异及寻找具有显著性差异的生物标志物，采用单维统计分析（独立样本t检验）对组间数据进行统计学分析，鉴别出生、醋组间具有显著性差异的13个代谢物（P

34生、醋莪术胆汁代谢物组间差异代谢物的鉴定

从生、醋组胆汁样品UPLCTOFMS总离子流图中根据表1罗列的13个差异代谢产物的m/z提取相应离子峰进行比对，采用AB Sciex的PeakView软件进行峰识别，对照METLIN，HMDB等化合物网络数据库，以误差小于10 ppm为界，综合分析鉴定了其中的8个潜在生物标记物，见表2。M2～M4，M6～M10及M12（M8，M9为同一物质），均为脂肪代谢过程中的相关物质，提示莪术醋制后对机体的脂质代谢过程产生了重要影响，但这些生物标记物的结构确认有待进一步研究。

35空白组与生、醋莪术组的差异代谢物分析

根据表2中8个潜在生物标记物的m/z，从样品UPLCTOFMS总离子流图中提取相应离子峰，进行生品组与空白组、醋品组与空白组的两两比对（由于M8与M9为同一物质，故分析时此2组强度相加），采用单维统计分析（独立样本t检验）对组间数据进行统计学分析，鉴别出空白组与生品组组间、空白组与醋品组组间具有显著性差异的代谢物（P

36代谢通路分析

本实验鉴定出的7种潜在生物标记物的主要代谢通路和生物功能见表3，可知这些潜在生物标记物主要与机体的脂质代谢途径相关，包括磷脂代谢、胆汁酸代谢和脂肪转化过程。由此推测莪术醋制后可能通过调控脂质代谢过程，促进脂肪转化，提高机体抗氧化能力而达到增强散瘀止痛的功效，其具体作用机制与信号通道需进一步研究。

4讨论

中药经炮制增效，效应的变化与炮制后化学成分改变有密切联系，而中药多成分难以其直接阐明；代谢组学可以从药物经体内代谢和药效作用后的生物标记物入手，通过分析不同状态下生物标记物的变化规律，探讨中药效应。本文基于UPLCTOFMS的代谢组学方法，采用单维统计与多元统计相结合，PeakView软件与网络数据库相比对的数据分析方法，分析醋制前后莪术提取物对大鼠胆汁代谢谱的影响，鉴定得7种潜在生物标记物（表3），并对其参与的代谢通路进行分析。

41磷脂代谢相关的潜在生物标记物

化合物M6，M4，M12分别被鉴定为溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，lysoPC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）和磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）。

大鼠给予醋莪术提取液后，体内LPC呈降低趋势，PE和PI呈升高趋势，这3种化合物均为体内内源性磷脂类成分，lysoPC是低密度脂蛋白的主要成分，被认为是影响血管内皮功能的重要因素之一，在动脉粥样硬化和炎症疾病中有重要作用。一般而言，它在细胞或组织中含量很少，如果浓度过高则会对细胞的膜系统造成伤害[5]。PE是甘油磷脂之一，是构成生物膜脂双层的基本骨架，王亮等[6]发现肝源性PE对肝癌细胞的生长具有明显的抑制作用，且能诱导其发生凋亡。PI是第二信使的前体，其4，5位羟基被磷酸化生成的磷脂酰肌醇4，5二磷酸（phosphatidylinositol 4，5bisphosphate，PIP2）是细胞膜磷脂的重要组成，主要存在于细胞膜的内层。在激素等刺激下可被裂解为甘油二酯和三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3），均为胞内传递刺激信号至细胞核的胞内第二信使。由此推测，莪术醋制后可以下调lysoPC的水平，上调PE和PI水平，调控机体的磷脂代谢，从而产生优于生莪术的疗效，起到“醋制入肝经”的效果。

42胆汁酸代谢相关的潜在生物标记物

化合物M8和M9被鉴定为牛磺鹅去氧胆酸（tauroursodeoxycholic acid，TCDCA），化合物M8和M9为TCDCA的不同加合离子峰，TCDCA为胆汁酸的重要组成成分。胆汁酸是胆汁中的一类胆烷酸的总称，按结构分为游离型和结合型，其中结合型胆汁酸是一类重要的生命物质，对脂肪代谢和调节胆固醇、磷脂、胆红素的溶解平衡及稳定起着重要作用[7]。与生莪术组相比，醋莪术组胆汁中的TCDCA量呈升高趋势，且由于牛磺鹅去氧胆酸在生品中未见与空白组的差异，提示莪术醋制后可调节胆汁酸的代谢从而达到入肝经的效果。

43与调控N酰基乙醇胺水解反应平衡作用相关的潜在生物标记物

化合物M3鉴定为Ncyclohexanecarbonylpenta decylamine NcyclohexanecarbonylpentadecylamineN cyclohexanecarbonylpentadecylamine是体内N脂肪酰基乙醇胺水解酶（Nacylethanolaminehydrolyzing acid amidase，NAAA）的选择性抑制剂[8]。NAAA是一类与酸性神经酰胺结构和功能相类似的水解酶，主要存在于溶酶体中，在巨噬细胞中有较高的表达，能够将脂肪酸链长度为C12～C20的N酰基乙醇胺（Nacylethanolamines，NAEs）水解为相应的脂肪酸和乙醇胺，从而抑制乙醇胺在体内生物活性的发挥。如N花生四烯酰乙醇胺（anandamide，AEA）储存与肝脏中，对于各种肝病均有潜在的治疗作用；棕榈酸乙醇胺（Npalmitoylethanolamine，PEA）是一类重要的镇痛、抗炎和神经保护物质。本实验发现醋莪术组大鼠胆汁中NAAA的选择性抑制剂含量始终高于生莪术组，提示莪术醋制后可能具有调控N酰基乙醇胺水解反应平衡的作用。

44与脂肪代谢相关的潜在生物标记物

化合物M7，M10分别被鉴定为deterrol stearate，人参环氧炔醇酯（panaxydol linoleate）。

deterrol stearate及panaxydol linoleate均为体内脂肪酸代谢途径中的化合物，醋制后呈现不同程度的升高，提示莪术醋制前后可能对机体脂质代谢途径产生了重要影响。

由以上结果可知，与生莪术组相比，醋莪术组大鼠胆汁中内源性代谢物中涉及到脂质代谢过程的标记物的量增加，提示醋制莪术组脂质代谢强于生莪术组，二者效应存在差异，代谢物组学可用于探讨炮制对中药效应的影响研究。

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