大鼠缺血再灌注损伤脑组织PPAR―γ1表达变化

摘要：目的：研究缺血再灌注大鼠损伤脑组织PPAR-γ1mRNA和蛋白的表达变化。

方法：建立SD大鼠右侧大脑中动脉栓塞（MCAO）缺血再灌注模型。实验分为对照组、假手术组和缺血再灌注组。缺血再灌注组取缺血后12h、24h和48h三个时间点进行观察。用RT-PCR方法及Westem blotting方法分别检测PPAR-γ1mRNA和蛋白的表达。

结果：脑缺血再灌注组PPAR-γ1mRNA和蛋白表达较正常对照组和假手术组明显降低。通过对缺血后12h、24h和48h三个时间点的动态变化观察发现，缺血后12h表达最低，并且随缺血后时间的推移，其表达逐渐增加，存在显著性差异（P

结论：实验SD大鼠缺血再灌注损伤脑组织PPAR-γ1表达下调，提示针对PPAR-γ1作为一靶点进行干预对于缺血性脑血管病的治疗是一个新的研究方向。

关键词：PPAR-γ1 脑缺血再灌注损伤

Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.08.020

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）08-0020-02

近几年的研究发现，PPAP-γ和缺血性病理损伤的关系密切。PPAR-γ能够减轻缺血再灌注损伤最早是由Wayman等[1]在急性心梗的动物模型中发现的，然后，很多研究都证明了PPARs及其激活剂对缺血再灌注损伤有益。Yosllida[2]等研究发现大鼠缺血再灌注肾脏PPARγmRNA表达下调，并提出PPAR-γ可能参与了肾脏缺血再灌注损伤。Chung等发现应用PPAR-γ激活剂罗格列酮和吡格列酮不仅可以减少肾缺血再灌注损伤，在糖尿病肾病、高血压肾病以及实验性肾小球肾炎都有保护作用。Cuzzocrea等发现PPAR-γ激活剂罗格列酮和吡格列酮可以明显减轻肺缺血再灌注损伤。此外，心脏、肝脏、消化道等很多器官都有报道。缺血再灌注脑组织是否存在PPAR-γ1的表达变化，目前文献报道不多。本研究观察了大鼠缺血再灌注脑组织中PPAR-γ1的表达变化，来初步探讨脑保护策略。

1 材料与方法

1.1 主要试剂。Adv-EGFP、Adv-PPAR-γ1、PPAR-γ1引物、PPAR-γ1多克隆抗体、IL-1β引物、ICAM-1引物（均购自上海吉凯基因化学有限公司），伊文氏蓝（美国SantaCruz公司），2，3，5三苯基氯化四氮哇（美国Sigma公司）。

1.2 动物选择与分组：将健康雄性SD大鼠，随机分为3组，正常对照组（10只）、假手术组（10只）、缺血再灌注模型组（30只）。大脑中动脉线栓闭塞90分钟后再通，MCAO术后随机分为3组（每组10只），分别用于MCAO后12h、24h和48h各时间点PPAR-γ1mRNA和蛋白表达的观察。正常对照组和假手术组于12h观察PPAR-γ1mRNA和蛋白的表达。

1.3 脑缺血再灌注模型建立：参照Longa法及其他改进方法制作大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型（MCAO）。将大鼠以10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉，行颈部正中切口，暴露右颈总动脉（CCA）及其分支颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），结扎ECA及CCA的近心端。然后在距CCA分叉部4mm处剪一小口，将拴线插入ICA缓慢入颅，通过CCA分叉处约（18.5±0.5）mm，当感到有明显阻力时停止，栓塞右大脑中动脉90min，拉出线栓至分叉部，使血流再灌注。

缺血后神经功能评分标准及动物模型入选标准再灌注24h后，分别采用5分制进行神经功能评分。

0分：无明显神经病学症状。

1分：不能完全伸展左前肢。

2分：行走时向左侧转圈。

3分：站立行走时向左跌倒。

4分：无自主行为活动及意识水平下降。

积分越高，说明大鼠行为障碍越严重。

动物模型入选标准：造模后大鼠虽然有神经缺失症状，但有下列情形之一者排除：

①依据5分制评分标准，神经缺失体征评分低于2分者。

②开颅发现并发蛛网膜下腔出血者。

③脑组织切片HE染色无缺血病理改变者。

④未达观察时相点死亡的大鼠。

因上述因素导致各实验组动物数不足预定数额者。

1.4 脑组织标本采集。各组动物到标本采集时间点时将实验动物以10%水合氯醛（3-4ml/kg）腹腔内注射麻醉完全，快速断头取脑，在额极后1，3，5，7，9，11mm处做间隔2mm厚的冠状切片共5片。取额极5-7mm和7-9mm脑片立即置于液氮中保存，备提取脑组织蛋白和RNA用。

1.5 RT-PCR方法测定mRNA表达1.8Western blot测定蛋白表达。

2 结果

2.1 总RNA提取。从大鼠脑组织中提取总RNA，取4ulRNA溶液在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，显示28S、18S和5S三条带清晰，比例适当。所有标本总RNA进行紫外分光光度计检测，A260/280比值在1.8-2.0之间，表明RNA无明显降解，无明显DNA污染，质量符合实验要求。

2.2 脑缺血再灌注后PPAR-γ1mRNA和蛋白表达变化。结果表明，脑缺血再灌注组PPAR-γ1的表达较正常对照组和假手术组明显降低。通过对缺血后12h、24h和48h三个时间点的动态变化观察显示，缺血后12h表达最低，并且随缺血后时间的推移，其表达逐渐增加，但至缺血后48h的表达值仍低于正常对照组和假手术组。

3 讨论

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是一种配体激活的转录因子，属于核激素受体超家族，参与多种代谢过程中的基因调控。自从1990年Isseman等从小鼠肝脏克隆出PPAR以来，人们对其生理和病理生理作用的研究已经取得了长足进展。它通过与位于靶基因启动子中的过氧化小体增殖物反应元件（Peroxisome proliferator respone element，PPRE）结合后调控靶基因的转录。PPAR-γ是PPAR的一种亚型，最初人们只注意到该受体在脂肪组织中表达，诱导脂肪细胞的分化，参与能量代谢调节。近几年的研究表明PPAR-γ也分布在一些非脂肪组织中，如骨骼肌、心肌、肾近球小管、结肠、骨髓基质细胞、炎性细胞和癌肿组织等部位，脑组织中同样存在PPARγ的表达。人们对其功能的认识研究也逐渐深入，特别是PPARγ和脑缺血再灌注损伤关系的研究取得较多的进展和发现。