栀子不同部位中活性成分的含量测定

摘要：目的 对生药栀子中几种活性成分进行定性定量分析，并对不同产地、不同部位中所含成分进行探讨。方法 采用液质联用技术对栀子水提取液进行活性成分测定。结果 中国产与日本产栀子中确定了京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷2种成分。不同产地栀子中主要成分含量稍有区别，但栀子果皮，种子等不同部位中主要成分含量与分布不同。结论 HPLC-MS/MS法可准确、快速、同时测定栀子中多种成分，对生药栀子的质量控制提供科学依据。

关键词：栀子；HPLC-MS/MS；京尼平苷；京尼平龙胆二糖苷

栀子（Gardenia jasminoides Ellis）：别名黄栀子、山栀、白蟾，是茜草科植物栀子的果实[1]，常用于蒙药、中药及日本汉方。蒙药药效：栀子蒙语名"朱如拉"，蒙药希拉汤和森登四味汤散的主要成分。具有清血热、明目、祛"巴达干协日"、生津、调元之功效[2]。中药药效：栀子的果实是传统中药，属卫生部颁布的第l批药食两用资源，具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用[1]。日本汉方药效：利胆、镇静、止血、解热为目的，用于精神不安、充血、黄疸等病状[3]。其化学成分主要含环烯醚萜类成分，如京尼平苷（geniposide）、京尼平龙胆二糖苷（genipingentiobioside）、羟异栀子苷（gardenoside）、京尼平苷酸（geniposidic acid）等[4]。笔者用HPLC-MS/MS法同时测定栀子中的活性成分，对其京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷2种成分进行了定性定量分析，结果已另文报道。本文对中国产和日本产栀子的成分含量进行对比，并对栀子的果皮、种子所含成分进行了分析。

1资料与方法

1.1仪器 高效液相色谱仪Prominence LC-20A（日本SHIMADZU）；液相色谱质谱联用仪API2000 LC/MS/MS三重四极杆质谱系统（美国AB SCIEX）；数控式超声波细胞粉碎器，SONOPULS UW2070，BANDELIN。

1.2试剂 色谱纯甲醇，（日本Wako）；蒸馏水，HPLC用蒸馏水；对照品：京尼平苷，（日本Wako，批号00007070-212）；京尼平龙胆二糖苷，（四川省维克奇生物科技，批号130527）；栀子（购于内蒙古中山路药店和日本口药店）

1.3方法

1.3.1对照品溶液制备 [对照品]对照品京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷分别配置1mg・ml-1的水溶液和1：1的混合对照品储备溶液，使用前再稀释100倍。

1.3.2供试品溶液制备 生药栀子研细，过60目筛，精密称取粉末0.5g，加超纯水10ml，超声 （70W、20kHz） 提取30min，高速离心机离心（3000rpm）20min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，既得。HPLC测定时再稀释1000倍后使用。

1.3.3色谱、质谱条件 [色谱条件] 色谱柱：ACE C8（100mm×2.1mm， 5μm）色谱柱；流动相：甲醇-水溶液（梯度洗脱）；流速：0.2 ml/min；检测波长：240 nm；柱温：30 ℃；进样量：0.5μl。

[质谱条件] 电离源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子检测；扫描范围：10～1100（m/z）。实验数据用AB SCIEX公司Analyst 1.4.2软件处理。

1.4方法学考察

1.4.1线性关系考察 精密吸取对照品京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的溶液，用超纯水配制分别为0.1、1、5、50、100 mg・ml-1等不同浓度的对照品溶液，每个浓度平行进样测定3次。以对照品浓度X（mg・ml-1）为横坐标，以色谱峰峰面积Y为纵坐标制作标准曲线。求得京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的直线回归方程及相关系数（r）分别为：

y=22863x-1045.2 r=1.000 00

y=18471x-3431.9 r=0.999 98

京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷均在0.1～100 mg・ml-1浓度范围内呈现良好的线性关系，分析方法学效能指标满足定量分析方法验证要求。

1.4.2加标回收率 精密吸取供试品溶液，分别添加低、中、高3个浓度的混合对照品溶液，进样0.5μl进行测定。每个添加水平测定5次，计算京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的平均加样回收率，见表1。

2结果

2.1对照品测定 取对照品溶液各0.5 μl注入高效液相色谱仪中，进行HPLC-MS测定。对照品的色谱图中京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的保留时间分别为15.23 min和14.16 min（图1A、B），质量电荷比分别为410.8 m/z，amu和572.9 m/z，amu（图1C、D）。对照品的准离子峰进行MS/MS测定，二级质谱碎片离子中分别测得质荷比22.8±0.5 m/z，amu的离子，推断为Na离子。从而确定，所测得中京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的质量电荷比为母离子加合钠离子形式出现（M+Na）。

2.2供试品测定

2.2.1不同产地栀子含量测定 HPLC测定不同产地栀子（中国产，日本产）水提取液，色谱图中不同产地栀子的三个峰的保留时间一致。其中峰1和峰2与对照品京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的保留时间完全吻合。分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各10μl，注入HPLC仪，测定色谱峰峰面积，外标一点法（外标法）计算含量，见表2。

由表2可知，中国产和日本产栀子中京尼平苷平均含量相当，中国产栀子中京尼平龙胆二糖苷平均含量比日本产略高。

2.2.2栀子不同部位含量对比 栀子果实剥皮，分别将栀子果实、果皮和种子按照"2.2"项分别制备供试品溶液，进行HPLC测定。色谱图中栀子（日本产）的不同部位的色谱峰有所不同（图2）。与栀子果实水提取液色谱图（图2A）比较，果皮水提取液无保留时间为14.17 min的峰（图2B），种子水提取液无保留时间为11.70 min的峰（图2C）。其中峰1和峰2与对照品京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的保留时间完全吻合。用HPLC仪测定色谱峰峰面积，外标法计算含量，见表3。

由表3可知，栀子果皮中京尼平苷平均含量不到果实的一半，几乎不含京尼平龙胆二糖苷，但峰3的含量明显高于果实和种子。栀子种子中京尼平苷平均含量为果皮的3倍多，京尼平龙胆二糖苷含量比果实多0.5倍，HPLC未测得峰3。

3结论

栀子主要产于中国、韩国、日本，用于中药、蒙药和日本汉方。中国产栀子形状长卵形、而日本产栀子相对短粗，但水提取液总离子流图基本一致，主要成分含量稍有区别。目前栀子的质量控制是以环烯醚萜类成分栀子苷含量的高低进行评价。本实验结果表明，中国产和日本产栀子药材样品中京尼平苷（栀子苷）的含量均符合《中国药典》不得低于1.8%的规定[1]。

本实验用液质联用技术确定了生药栀子中京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷等2种成分，并对不同产地栀子及其不同部位中的成分含量进行了测定。该方法准确、快速、能够同时测定栀子中几种成分，可作为生药栀子的质量控制的有效方法。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：231-232.

[2]中华人民共和国卫生部标准[S].蒙药分册，1998，2.

[3]原岛广至.生药单[S].NTS，2007：124-125.

[4]颜升，董艳凯，陈健，等.中药栀子的研究现状[J].安徽农业科学，2013，41（18）： 7759-7760，7772.