胃癌组织中KAI1 mRNA表达的意义

作者：刘茗露 刘斌 邢传平 陈一伟 郭峰

【摘要】

目的： 探讨KAI1基因和蛋白在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及癌组织中的表达及其与之发生、发展的关系. 方法： 应用原位杂交技术和免疫组织化学技术检测不典型增生胃黏膜65例及胃癌组织74例中KAI1mRNA和 KAI1蛋白的表达. 结果： KAI1 mRNA和KAI1蛋白在胃癌组织中表达显著降低，与正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜组织中表达的差异有显著性意义（χ2=36.328，P<0.05）. 在胃癌组中不同的浸润深度、有无淋巴结转移和脉管侵犯组中阳性表达率的差异性有统计学意义（P<0.05）；而在年龄、性别组间的差异性无统计学意义（P>0.05）. 结论： KAI1mRNA和蛋白低表达在胃癌组织中的发生、发展中可能起着重要作用，有望成为早期诊断、评估肿瘤细胞侵袭转移潜能的指标之一.

【关键词】 胃肿瘤 KAI1 原位杂交 免疫组织化学

0引言

胃癌是消化道最常见的肿瘤， KAI1基因产物与CD82结构相同，参与细胞黏附、运动和信号转导，与多种肿瘤的转移和预后有密切关系［1］，作为一个肿瘤转移抑制基因，表达降低可使细胞?细胞基质的黏附力改变及细胞间相互作用降低. 故KAI1基因在胃癌组织中的表达水平值得关注，但国内及国外目前对于KAI与消化道肿瘤的报道意见不甚一致. 我们用原位杂交法和S?P 免疫组化方法检测正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及癌组织中KAI1mRNA和KAI1蛋白的表达，以探讨在胃癌发生发展、转移浸润过程中相关基因间的作用、关系及其意义，为该肿瘤的诊断治疗提供依据.

1材料和方法

1.1材料2004?08/2005?07病理科存档石蜡标本. 不典型增生胃黏膜65例，轻、中、重度不典型增生分别为20，21和24例. 胃癌组74(男49，女25)例，年龄30～84（中位62）岁，术前均未行放疗和化疗，高、中、低分化腺癌分别为21，24，21例,黏液细胞癌8例；淋巴结转移阳性组36例，淋巴结转移阴性组38例；有脉管侵犯者25例，无脉管侵犯者49例；标本均经40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚切片，分别进行HE、免疫组化及原位杂交染色. 同时取距离肿瘤组织>5 cm的胃黏膜22例作为非肿瘤组织对照. 胃癌组织20例采用了组织芯片的方法；其余组织则采用了常规切片的制作方法. 兔抗人KAI1，过氧化酶标记的链霉卵白素染色试剂盒、DAB显色试剂盒及原位杂交检测试剂盒（Pan?Path产品）购自北京中杉金桥生物技术有限公司. 鼠抗人KAI1单抗为美国Pharmingen公司产品. KAI1寡核苷酸探针序列为：① 5′AGGA TCCAC ACCCC GAAGC CCAGG ATCACT 3′；② 5′CAGCG CTTCA CCTGA GCCTG CACGT AGTCC 3′探针片段长度21 bp，3′端标记地高辛，由上海生工有限公司合成. 组织芯片制作：用特殊基质制作25 mm×25 mm×5 mm的空白载体；用直径0.5 cm的骨髓穿刺针在每块空白基质载体打孔，相邻孔间为1 mm；对常规固定的的大体胃癌标本进行穿刺，获取直径为0.4 cm柱形组织，放入基质载体已打好的孔里，癌组织部分朝向包埋面，进行脱水、浸蜡、包埋. 制作组织芯片蜡块，将组织芯片蜡块以4～6 μm厚连续切片，敷贴于10 g/L多聚赖氨酸处理的载玻片上，分别进行HE染色、免疫组化及原位杂交染色.

1.2方法

1.2.1原位杂交所有器皿、玻片、缓冲液、双蒸水均予灭活RNA酶处理，玻片及盖玻片均予硅化处理. 石蜡切片常规脱蜡至水，30 mL/L H2O2室温处理10 min以灭活内源性过氧化物酶，双蒸水洗涤3 min×2次. 切片上滴加30 mL/L盐酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化30 min，级别乙醇中脱水. 变性及杂交：每张切片加地高辛标记KAI1探针20 μL，加专用盖玻片，置95℃烤箱变性5 min；37℃杂交过夜，TBS液洗涤去掉盖玻片，加生物素化鼠抗地高辛，37℃孵育30 min，TBS液洗涤3 min，双蒸水洗涤1 min，DAB显色，苏木素复染，封片. 实验设空白对照和阳性对照（采用在所有人体组织中均表达的人Alu片断寡核苷酸探针）. 原位杂交胞膜上及胞质中出现棕褐色颗粒为阳性染色，（-）为无杂交信号；（+）杂交信号为弱阳性；（?）杂交信号为阳性；（?）杂交信号为强阳性.

1．2．2免疫组化组织切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水后行免疫组化染色. 采用高压锅高温抗原修复后，余步骤按S?P法试剂盒说明书进行操作. DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固. PBS代替一抗作为阴性对照. 免疫组化KAI1蛋白阳性为胞膜上及胞质中出现棕褐色颗粒. 采用双盲法对每张切片在高倍镜（×400）下计数10个视野，首先按染色强度评分，无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；再以阳性细胞所占百分比评分，阴性为0分，阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分. 染色强度计分与阳性细胞百分比评分之和＞2者为免疫组化阳性.

统计学处理：　采用χ2检验和Spearman秩相关分析，用 SPSS10.0统计软件包进行统计学处理.

2结果

2．1胃组织KAI1基因表达KAI1基因mRNA在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌细胞胞质中信号表达（图1A～D），阳性率呈递减趋势， χ2检验显示KAI1基因mRNA组间差异性有统计学意义（χ2=108.403, P<0.05）； 其蛋白在正常胃黏膜及不典型增生胃黏膜腺上皮细胞质中为阳性表达，在胃癌细胞质中基本为阴性表达，其蛋白阳性表达率在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌各组间呈递减趋势，χ2检验显示组间阳性率差异性有统计学意义（χ2=36.328，P<0.05，表1）.

2.2KAI1基因表达与临床病理的关系经χ2检验和Fisher精确概率法检验，KAI1基因mRNA和蛋白表达在不同浸润深度、有无淋巴结转移组、有无脉管侵犯组内表达率的差异性有统计学意义(P<0.05),在年龄及性别组内表达率的差异性无统计学意义. Spearman等级相关分析显示KAI1基因mRNA和蛋白表达呈正相关（r=0.967, P=0.001）. 正常胃黏膜和不典型增生胃黏膜中细胞核内均未见KAI1基因扩增，但部分胃癌组织中可见癌细胞核中有基因扩增，且其表达趋势与KAI1 蛋白和胞质内mRNA表达呈相反趋势(表2). 表1胃黏膜组织中KAI1蛋白和KAI1 mRNA阳性表达与临床参数表2胃癌中KAI1蛋白阳性表达及核内基因扩增和细胞质内表达的相关型性

3讨论

胃癌的发生、发展是一个涉及多个基因突变的过程及多种分子遗传学改变［2］的多阶段、多因素特征［3］. 肿瘤抑制基因失活是导致肿瘤发生最重要的分子生物学基础. KAI1基因是一个肿瘤转移抑制基因. Lijovic等［4］研究发现，KAI1基因在良性前列腺增生中呈高表达，而前列腺癌中表达减低，其表达与组织分化呈负相关. Uzawa等［5］研究证实，KAI1基因缺失表达与口腔鳞癌转移有明显相关性(P<0.05). Yang等［6］研究发现，与正常组织比较，未转移癌组织中有明显的KAI1 mRNA及蛋白水平的表达缺失；而在转移癌组织中表达水平又有所恢复，并且表达水平与存活率呈负相关(p= 0. 002). Lee等［7-8］研究也表明，胃癌预后差与KAI1低表达有关，而在正常胃腺体及胃癌组织中KAI1mMRA表达无统计学差异. 但多数学者认为，KAI1基因在肿瘤发生早期高表达，而在肿瘤进展期或发生转移时低表达，说明KAI1基因的表达呈双相改变［5］，即在早期KAI1基因的高表达对肿瘤的恶性进展起抑制作用，而一旦无法保持KAI1基因的高表达，则肿瘤进入进展期并开始发生侵袭和转移. 由此可见，KAI1可以抑制胃黏膜上皮细胞的恶性转化以及癌细胞的浸润和转移，并可作为肿瘤预后的一个指标［1，9］.

我们研究发现，正常胃黏膜组织有较强的KAI1阳性表达，同时发现重度不典型增生组织KAI1表达较正常胃黏膜组织略下调，但差异无显著性，而胃癌组织KAI1表达较正常胃黏膜组织明显下调，与Lijovic等［4］和Uzawa等［5］的研究结果一致，表明KAI1作为肿瘤转移抑制基因，其功能失活或降低可能与胃癌的发生、发展相关. 本研究结果还表明，在胃癌组织中KAI1蛋白的表达与患者淋巴结转移胃癌组内及不同浸润深度胃癌组内表达的差异性有统计学意义(P<0.05),在有无脉管侵犯组、年龄及性别组内表达的差异性却无统计学意义，这可能是病例数太少所致，有待于今后增大样本量继续研究. 由此可见，KAI1基因低表达可能是肿瘤发生、发展的相关因素，KAI1可望作为肿瘤分子生物学标记之一，对胃癌患者进行KAI1蛋白检测有可能成为临床判断胃癌分化程度、浸润深度及转移潜能的重要指标，并为治疗及预后提供分子生物学参考依据.

【参考文献】

［1］Yang X, Wei LL, Tang C, et al. Overexpression of KAI1 suppresses in vitro invasiveness and in vivo metastasis in breast cancer cells［J］.Cancer Res,2001,6(13):5284-5288.

［2］Shinohara T, Miki T, Nishimura N, et al. Nuclear factor?kappaB?dependent expression of metastasis suppressor KAI1/CD82 gene in lung cancer cell lines expressing mutant p53［J］. Cancer Res,2001,61(2):673-678.

［3］Jackson P, Grimm MO, Kingsley EA, et al. Relationship between expression of KAI1 metastasis suppressor gene, mRNA levels and p53 in human bladder and prostate cancer cell lines［J］. Urol Oncol, 2002,7(3):99-104.

［4］Lijovic M, Somers G, Frauman AG. KAII/CD82 protein expression in primary prostate cancer and in BpH associated with cancer ［J］. Cancer Detect Prev,2002，26(1):69-72.

［5］Uzawa K, Ono K, Suzuki H, et al. High prevalence of decreased expression of KAII metastasis suppressor in human oral carcinogenesis［J］. Clin Cancer Res, 2002，8(3):828-831.

［6］Yang JL, Jackson P, Yu Y, et al. Expression of the KAII metastasis suppressor gene in non?metastatic versus metastatic human colorectal cancer ［J］. Anticancer Res ,2002， 22(6A):3337-3341.

［7］Lee HS ,lee HK,Kim HS,et al .Tumour suppressor gene expression correlates with gastric cancer prognoses［J］. J Pathol,2003,200(1):39-46.

［8］Lee JH, Seo YW, Park SR, et al. Expression of a splice variant of KAI1, a tumor metastasis suppressor gene, influences tumor invasion and progression［J］. Cancer Res，2003 ，63(21):7247-7255.

［9］季润元，沈阳，王成海，等. KAI1/CD82蛋白表达与食管癌淋巴结转移的关系［J］. 实用癌症杂志，2004, 19(4):379-380.