原位杂交检测湖北钟祥河南移民及湖北本地居民食管癌组织中HPV

作者：黄环元 付由高 姚品芳 李广灿 夏和顺 杨小玲 王瑞勤 王锡印 沙聚伟

【摘要】 目的 检测湖北钟祥河南移民及湖北本地居民食管癌组织中人状瘤病毒感染情况及感染后的意义。方法 采用原位杂交法检测82例食管鳞癌组织中HPV感染。同时以40例正常鳞状上皮组织作正常对照。结果 在三组研究对象中均发现有HPV感染，阳性率分别为30.0%（6/20），25.0%（10/40），31.8%（7/22）；40例正常鳞状上皮组织中无一例HPV阳性。统计学结果显示实验组与对照组具有显著统计学意义（P＜0.01），三个实验组之间无统计学差异（P＞0.05）。结论 湖北钟祥河南移民和湖北本地居民食管癌组织中存在HPV感染，HPV感染可能与食管癌的发生和进展有关。

【关键词】 食管癌；人状瘤病毒；原位杂交

The compare of HPV infection in esophageal carcinoma in Henan emigration of Hubei Zhongxiang and Hubei native residenter

【Abstract】 Objective To investigate the HPV infection in esophageal carcinoma in Henan emigration of Hubei Zhongxiang and Hubei native residenter， and their relations to progression of esophageal carcinoma.Methods In-situ hybridization(ISH) was performed in 82 cases human esophageal carcinoma tissue and 40 cases normal esophageal tissue was used as normal controls.Results The HPV positive rate was 30.0%（6/20），25.0%（10/40），31.8%（7/22）respectively in esophageal carcinoma tissues from Zhongxiang， Hubei native residenter(Macheng)， and Hubei cancer hospital. HPV were negative in all 40 normal esophageal tissue.The positive rate of HPV was significant between experiment group and control group(P<0.01)；in the three experiment groups，the expression level of HPV was no significant(P>0.05).Conclusion HPV positive cells can be found in Hubei Zhongxiang and the other areas；which may contribute to formation of esophageal carcinoma.

【Key words】 esophageal carcinoma；human papillomavirus(HPV)；in-situ hybridization(ISH)

许多研究显示，食管癌的发生与人状瘤病毒的感染有关。由于检测方法、标本来源和标本数量的不同，过去报道的食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）组织中HPV感染的阳性率差异很大。我们采用原位杂交法对食管鳞癌及癌旁组织进行HPV检测，探讨湖北钟祥河南移民及湖北本地居民食管癌组织中人状瘤病毒感染情况及感染后的意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集食管癌高发区湖北钟祥柴湖乡卫生院经手术切除的食管鳞状细胞癌组织存档蜡块20例。年龄41～70岁，平均年龄58岁。核查病历证实，20例患者均为河南移民。

同时收集湖北麻城地区本地食管鳞状细胞癌患者22例，年龄33～67岁，平均年龄55.7岁。湖北省肿瘤医院散发的经手术切除的食管鳞状细胞癌存档蜡块40例，年龄37～75岁，平均年龄56.9岁。核查病历证实，62例患者均为本地籍。

全部标本的组织切片在进行原位杂交检测前均已进行常规HE染色，由经验丰富的病理医生再次病理证实并进行病理分级。采用经病理证实的40例形态学正常的食管

状上皮组织作正常对照。

1.2 方法 蜡块连续切片，每片5μm厚，分别做HE染色、免疫组化染色和DNA原位杂交。载玻片均使用经多聚赖氨酸处理的玻片。

本实验采用DAKO公司的K0601 HPV原位杂交试剂盒，Y1412 生物素标记探针HPV DNA(16/18)。基本参照DAKO公司提供的操作程序进行原位杂交（in-situ hybridization，ISH），根据本实验室条件略做改动。切片脱蜡至水，0.8％胃蛋白酶37℃消化10min，滴加探针HPV DNA(16/18)溶液（15～20μl），盖上盖玻片，置PCR仪90℃变性5min后，立即将切片移入预热的湿盒内37℃杂交60min。浸入TBS溶液，移去盖玻片，置试剂盒专用清洗液58℃30min中止杂交。TBS洗片，滴加链亲和素－碱性磷酸酶复合物(Streptavidin-AP)室温20min，BCIP/NBT底物显色、避光、60min，核快红复染，常规封片，镜检。镜下可见HPV DNA 阳性细胞核内呈蓝黑色微细颗粒。

ISH实验设以下对照：(1)不加HPVDNA（16/18）探针；(2)杂交后不加链亲和素－碱性磷酸酶复合物；(3)加HPVDNA（16/18）探针但未经90℃热变性即进行杂交实验。

1.3 结果判定和统计学分析 ＋表示5%～25% 阳性细胞，＋＋表示25%～50% 阳性细胞，＋＋＋～＋＋＋＋表示阳性细胞 >50%。所得结果应用Fisher′s 方法精确检验。

2 结果

食管鳞癌组织的HPVDNA的原位杂交实验检测结果见表1。

表1 食管癌组织ISH检测HPV阳性率

注:①②③之间比较P＞0.05(P值＝0.903)；④与①②③之间比较P＜0.01(P值＝0.0017)

钟祥柴湖河南移民的20例ESCC标本中，ISH阳性者6例，阳性率为30.0%（6/20）；湖北本地居民标本阳性率为25.0%（10/40）；湖北省肿瘤医院ESCC标本阳性率为31.8%（7/22）；所检测的40例正常上皮组织无一例阳性表达。结果显示，①②③阳性率之间P＞0.05差异无显著性；④与①②③之间P＜ 0.01差异具有显著性。

HPV(16/18)DNA 阳性杂交点位于细胞核内。在癌巢中，阳性细胞大多位于癌巢中间部分，阳性细胞的形态多为短梭形或不规则形。且细胞形态越不规则阳性表达越高。

3 讨论

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，具有明显的地域性差异，其发生与遗传、环境、饮食和某些微生物的感染密切相关。许多研究表明，食管癌的发生与HPV感染有关。我们采用高特异性ISH方法检测湖北钟祥河南移民、湖北本地居民及本院患者ESCC中HPV感染情况。结果显示三组实验标本之间HPV的阳性率没有明显差异。光镜下可见所有HPV DNA阳性细胞均位于肿瘤组织的中央区域，说明ISH检测到的HPV DNA不是外来感染所致，而是肿瘤细胞核内原本存在的。而三组实验标本与正常鳞状上皮组织的HPV感染则具有显著差异。笔者的研究结果与林俊杰等［1］采用DAKO HPV原位杂交试剂盒观察33例ESCC中HPV DNA 24.2%的阳性率基本一致。匡忠生等［2］应用型特异性引物PCR检测56例食管癌组织中HPV16，18的感染率，采用Southern blot 杂交检测HPV16在食管中的存在状态。结果HPV16，18的感染率分别为39%和2%，并且在部分病例HPV16 DNA 以整合形式存在。河北食管癌高发区磁县食管癌患者HPV DNA检出率为20.3%，虽高于非高发区患者的HPV阳性率（8.3%），但经统计学处理两者差异无显著性。该结果与本研究结果相近［3］。在本研究中发现钟祥柴湖河南移民和湖北本地居民及湖北省肿瘤医院的食管癌患者均有HPV的感染，而三者之间没有统计学差异。与本实验采用免疫组化检测的结果一致［4］。提示HPV感染与食管癌有关，可能为食管癌的病因之一。其作用的分子机制有待进一步探讨。

【参考文献】

1 林俊杰，张锦霞，宗永生.食管鳞状细胞癌中人状瘤病毒感染的意义.广东医学院学报，1998，16（3）：186-188.

2 匡忠生，唐纯志，沈忠英.食管癌患者中HPV16，18的检测.广东医学，2000，21（4）：305-306.

3 刘艳丽，李学民，靳国梁，等.河北磁县食管癌高发区食管鳞状细胞癌组织HPV检测及FHIT表达的研究.癌症，2003，22（5）：492-495.