C-jun 在慢性支气管炎大鼠肺中的表达及与气道重塑间的关系初探

【摘要】 目的 观察香烟暴露诱导慢性支气管炎模型大鼠肺组织中cjun表达及与小气道重塑间关系。方法 40只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、吸烟30 d组(Ⅰ组)、吸烟60 d组(Ⅱ组)及吸烟90 d组(Ⅲ组)；被动吸烟诱导大鼠慢性支气管炎模型， 镜下比较各组大鼠细支气管平滑肌及胶原层变化，免疫组织化学法检测肺组织中Cjun 表达蛋白JUN 的水平。 结果 吸烟大鼠30 d后气道发生明显慢性炎症变化，与对照组比较，Ⅱ组、Ⅲ组大鼠细支气管管壁厚度与气管外径比值(MT%)及管壁面积与气管总面积比值(MA%)显著增高(P

【关键词】 吸烟；慢性支气管炎；cjun；气道重构

1 材料与方法

11 主要试剂及仪器 CJun 兔多克隆抗体、鼠抗兔二抗为Santa Cruz 产品；SABC免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。Masson 胶原染色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。HPLAS1000高清晰度彩色病理报告分析仪及计算机图象处理系统及相应软件(德国Opten)。

12 动物模型的建立、分组及标本处理 实验动物为清洁级SD大鼠，2个月龄雄性大鼠40只，体重(200±20)g，购自中山大学中山医学院实验动物中心。大鼠随机分为正常对照组、吸烟30 d组(Ⅰ组)、吸烟 60 d组(Ⅱ组)、吸烟 90 d组(Ⅲ组)，每组均为10只。参照许三林等的方法制作被动吸烟装置［1］。实验香烟为武汉市售红双喜牌香烟(武汉卷烟厂制)，尼古丁含量为每支1 mg，焦油含量每支18 mg。 吸烟组放人自制的吸烟箱中，每次点燃2支香烟放入，燃烧10 min，休息5 min后再放入2支香烟，每天吸烟40支，每周吸烟6 d。分别在吸烟30、60、90 d后处死各组大鼠。分离肺组织, 左下叶置于4%甲醛固定液中保存，常规石蜡包埋、切片 4 μm，组织学检查(HE与Masson染色)及免疫组化备用。

13 指标观察

131 肺细小支气管病理及形态学测定 石蜡切片做Masson染色，测定直径在750～1100微米 之间，长径与短径之比不小于07的膜性细支气管的外径、管壁厚度(中膜肌层)、管壁面积和气管总面积，然后计算管壁厚度与气管外径比值(MT％)，管壁面积与气管总面积比值(MA％)，并计算出均数，作为大鼠的肺细小支气管气道重构定量指标观察。

132 Cjun 基因表达蛋白JUN免疫组化染色 采用链霉亲和素过氧化氢物酶法(SABC法)，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作；用001 mol／L 磷酸盐缓冲液和正常羊血清取代一抗作为空白对照与替代对照。光镜下每张切片随机选5个含有完整支气管横断面的区域，计算阳性细胞个数并作分析。

14 统计学处理 全部数据均以x±s表示。数据采用SPSS 110软件进行方差分析，以LSD法进行不同组别之间的两两比较。

2 结果

21 HE染色观察 HE染色镜下观察：对照组气管、肺泡组织结构正常；Ⅰ、Ⅱ组大鼠肺组织中可见明显慢性细支气管炎，炎症侵犯细支气管全层，炎症细胞侵及全层(包括固有膜、中膜肌层和外膜)，炎症细胞包括单核巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等多种细胞，以单核巨噬细胞、淋巴细胞为主，黏膜下腺体增生明显(图2)；而Ⅲ组大鼠与Ⅰ、Ⅱ组比较，除细支气管全层炎症变化外，可见到小气道全层炎症向周围肺组织扩散，细支气管中膜肌层平滑肌显著增生、肥厚，排列紊乱，并有广泛的肺气肿形成。

22 各组大鼠细支气管平滑肌层及胶原厚度的比较 Masson染色：对照组及Ⅰ组大鼠细支气管平滑肌层菲薄，Ⅱ、Ⅲ组细支气管中膜肌较正常组显著增生肥厚(P

23 各组大鼠肺组织JUN表达的比较 正常对照组大鼠肺内几乎无JUN 蛋白阳性染色，Ⅰ组大鼠气道JUN 蛋白表达较对照组明显增加(P

3 讨论

慢性支气管炎小气道慢性炎症持续存在，迁延进展，气道炎症导致的组织损伤修复反应可出现气道重构，平滑肌细胞增生及结缔组织沉着，从而使末梢气道腔内呈物理性狭窄，导致肺功能进行性减退。cjun是禽肉瘤逆转录病毒基因ASV17 的细胞内同源基因，由 Bohmann 于1987年发现［2］。Cjun原癌基因产物Jun为39 kD蛋白，与原癌基因 cfos产物Fos结合形成异二聚体AP1或多聚体型反式因子，经由亮氨酸拉链与DNA上相应基因增强子结合起正调控作用。细胞内cjun借助于其碱性亮氨酸拉链和Jun家族的其他成员或Fos家族成员形成同源或异源二聚体，组成 AP1转录因子，结合DNA 的TPA 元件调控区，在转录水平调节下游靶基因的表达，进而调控细胞蛋白质的合成，影响着细胞的增殖与分化等多种病理变化。

本实验观察到在Ⅰ组大鼠在被动吸烟1个月后，中小支气管出现慢性气道炎症，随着吸烟时间的延长，气道炎症逐渐加重；JUN 蛋白阳性染色细胞亦出现由少致多的变化，JUN蛋白阳性染色细胞多分布于气道上皮细胞、支气管平滑肌及全气道壁的慢性炎症细胞中，并呈逐渐增多趋势。香烟烟雾产生的氧化应激，能激活气道上皮细胞中的MAPK信号通路，进而增强cjun 活性，激活AP1 相关靶基因，产生增殖、分化、炎症等病理变化［3，4］。Rahman 等学者发现香烟烟雾引起的氧化自由基可激活脂氧化物酶途径并调节DNA 组蛋白结构，可进一步激活AP1 及NFκb等转录因子，活化一系列致炎性因子如TNFα等的表达，促进炎症的发生发展［5］。另有学者发现在吸烟者及实验动物气道上皮在香烟烟雾诱导的氧化应激反应，还可引起NFκB及AP1与DNA结合的明显增加，明显增加巨噬细胞炎性蛋白等炎症因子的表达［6］。提示在香烟诱导的慢性支气管炎中，氧化应激对气道造成的损伤可能通过不同途径诱导cjun等转录因子表达后，通过调节一系列相关基因的表达将炎症反应放大，而随着香烟暴露时间的延长，Cjun表达明显增高，炎症反应亦逐渐加重。