雷帕霉素抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞增生

作者：尚明花 范昱 姚建 董维平 张政 黄一新 徐培桢

【摘要】 目的 免疫抑制剂雷帕霉素对血管紧张素Ⅱ诱导的脐静脉内皮细胞（HUVEC）抑制作用机制。方法 血管紧张素Ⅱ联合不同浓度雷帕霉素刺激体外培养的HUVEC，3H-胸腺嘧啶核苷掺入法和3H-亮氨酸掺入法测定瞎胞DNA和蛋白质合成，流式细胞术检测细胞周期变化，免疫印迹（Western blot）检测细胞信号蛋白p70S6K，ERK2及细胞周期蛋白CyclinD1、CyclinA、和CyclinB1表达的变化。结果 雷帕霉素抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞蛋白质和DNA的合成，并呈剂量依赖效应（P<0.01），雷帕霉素抑制p70S6K和CyclinD1的表达，阻滞细胞于G1期（P<0.01），而不影响ERK2，CyclinA、和CyclinB1的表达。结论 PI3K-p70S6K信号通路在血管紧张素Ⅱ诱导的HUVEC增殖及细胞周期进程中起关键作用，p70S6K是免疫抑制剂雷帕霉素阻断血管内皮细胞增殖靶点。

【关键词】 雷帕霉素 血管紧张素Ⅱ 信号传导 DNA合成 血管内皮细胞

Rapamycin inhibits the proliferation of vascular endothelial

【Abstract】 Objective To investigate the inhibition of rapamycin in angiotensin Ⅱ -induced vascular endothelial cell proliferation.Methods Cultured HUVEC were stimulated by AngⅡ alone or in combination with different concentrations of rapamycin. The cell proliferation was measured by 3H-thymidine incorporation and 3H-leucinne incorporation. Cell cycle were analysed by flow cytometry. Expression of p70S6k ，ERK2， cyclinA， cyclinB1 and cyclinD1 were detected by Western blots.Results Rapamycin inhibited AngⅡ-induced increase in protein content and DNA synthesis with dose dependently(P<0.01). Rapamycin inhibited the expression of p70S6k and cyclinD1 while inducing G1 cell cycle arrest (P<0.01) without affecting the expression of ERK2， cyclinA and cyclinB1.Conclusion p70S6k signaling appears to be necessary for G1-S phase progression and proliferation in AngⅡ-induced HUVEC.Rapamycin targeted p70S6k could have great potential in therapeutic intervention in the proliferation of vascular endothelial cells.

【Key words】 rapamycin angiotensinⅡ signal transduction DNA synthesis vascular endothelial cell

血管紧张素Ⅱ不仅是一种肽类激素，具有多种生物学功能包括促进血管收缩，刺激醛固酮分泌和肾脏对钠重吸收，而且，血管紧张素Ⅱ对成纤维细胞、肾上腺皮质细胞、血管平滑肌细胞和心肌细胞等多种细胞发挥生长因子的作用［1，2］。它能诱导细胞增生导致组织结构重构，因此，阻断血管紧张素Ⅱ的生物学效应对预防潜在的病理生理事件的发生具有重要意义。

雷帕霉素是一种强效免疫抑制剂和抗肿瘤药物，它通过抑制哺乳类雷帕霉素靶分子（mTOR）抑制蛋白质合成和使细胞阻滞于G1期。mTOR是核糖体的合成、蛋白质的合成及细胞生长的关键调节因子，它通过抑制p70S6激酶的活化和4EBP1 磷酸化调控氨基酸和生长因子刺激的蛋白质翻译过程。近期的研究资料提示雷帕霉素在抑制血管内皮细胞增生中发挥重要作用［3］，然而，雷帕霉素抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞增生信号传导机制仍然不清。

Ras-p42/p44 MAPK及phosphatidylinositol 3-kinase-p70S6 kinase (PI3K-p70S6K)两条信号传导路径在细胞增生方面都扮演重要的角色，为了阐明雷帕霉素对血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞的影响，我们的实验研究雷帕霉素 和血管紧张素Ⅱ刺激人脐静脉内皮细胞后，细胞DNA和蛋白质合成以及促进合成增加的主要信号蛋白ERK2、p70S6K和细胞周期蛋白的。

1 实验方法

1.1 细胞培养 本实验采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株HUVEC（ACTT No CRL-1998）为研究对象，细胞生长于含10%新生牛血清的RPMI 1640 培养基中（GIBCO），含1%的青-链霉素，在5％CO2，37℃培养箱内孵育，雷帕霉素溶于DMSO（SIGMA）终浓度分别为1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，细胞在无血清培养基孵育48h后，换无血清RPMI1640、AngⅡ 10-6M、AngⅡ 10-6M联合不同浓度雷帕霉素（1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml）继续孵育24h。

1.2 测定细胞的DNA和蛋白质合成 细胞接种于96孔板，不同浓度雷帕霉素（1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml）刺激30min后，加含AngⅡ 10-6M无血清培养基孵育24h，在收集细胞前12h，每孔加入1μCi/ml氚标胸腺嘧啶核苷或氚标亮氨酸(3H-TdR，3H-亮氨酸，北京原子高科核技术应用股份公司)，甲醇固定后10%三氯醋酸洗2次，每孔加0.1N NaOH及液态闪烁体（Amersham NBCS 104），用BECKMAN LS6500液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲（cpm）。

1.3 流式细胞术检测细胞周期 1×108细胞接种于25cm2培养瓶，分别用不同浓度rapamycin和AngⅡ 10-6M刺激细胞，PBS洗2次后，70%冰乙醇固定1h，加入含RNA酶（10μg/ml）和碘化丙啶（500μg/ml）的PBS液，4℃避光反应1h，流式细胞仪MultiCycle软件检测细胞周期。

1.4 免疫印迹（Western blot）检测P70s6k，ERK2和细胞周期蛋白 细胞接种于75cm2培养瓶，换无血清培养基孵育48h使细胞同步化，然后分别加入Rapa10nM，Rapa100nM，30min后用AngⅡ 10-6M刺激细胞，继续孵育24h，提取蛋白。RIPA裂解液（50mM Tris，150mM NaCl，5mM EDTA，1％NP40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，1mM PMSF，10μg/ml aprotinin，1mM NaVO4）裂解细胞，12000×g，4℃离心15min，提取上清，Bradford法测定蛋白浓度后，取等量蛋白样品点样，8%SDS-PAGE凝胶进行电泳，半干转至PVDF膜上，900 mA 1h，含10%脱脂奶粉TBST 37℃封闭1h，加兔抗人p70S6K多克隆抗体（R&D 1：2000），兔抗人ERK2多克隆抗体(ZYMED LABORATORIES 1：2000)，单克隆抗体CyclinD1、cyclinA、cyclinB1(NEOMARKERS 1：400)为第一抗体，鼠抗人β-actin单克隆抗体（NEOMARKERS1：400）为对照，4℃过夜，TBST充分洗涤后加HRP标记IgG（PIERCE 1：10000）为第二抗体，室温作用1h，Β-actin（NEOMARKERS1：400）作为对照，洗膜后ECL系统(PIERCE)显色，复日smstyview生物电泳图像分析系统进行分析。

1.5 统计学分析 数据结果用x±s表示，全部数据用SPSS 10.0统计软件进行处理，组间均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性。

2 实验结果

2.1 雷帕霉素对AngⅡ诱导HUVEC的蛋白质和DNA合成影响 血管紧张素Ⅱ刺激24h后，蛋白质DNA合成增加。加用雷帕霉素后呈剂量依赖性抑制作用，加10ng/ml雷帕霉素组氚标亮氨酸合成减少37.6%(P<0.05)，加100ng/ml雷帕霉素组氚标亮氨酸合成减少51.1%(P<0.05)。氚标胸腺嘧啶核苷合成实验显示， 加用雷帕霉素1.0ng/ml组和10ng/ml组DNA合成分别降低71%和80%，加用雷帕霉素100ng/ml组DNA合成降低近90%(图1，2)。图3显示，雷帕霉素抑制血管内皮细胞DNA合成与抑制蛋白质的合成相关，且与p70S6K表达降低相一致(图4)。这些结果提示雷帕霉素抑制有丝分裂的原因可能是抑制血管紧张素Ⅱ诱导蛋白质合成。

Fig 1 Rapamycin inhibited the Ang Ⅱ induced increase in protein content in HUVEC. *P<0.01 compared with control, # P<0.01 compared with Ang Ⅱ 10-6 M group

Fig 2 Rapamycin inhibited the DNA sythesis induced by Ang Ⅱ in HUVEC.*P<0.01 compared with control, #P<0.01 compared with Ang Ⅱ 10-6 M group

Fig 3 Inhibition of DNA synthesis by rapamycin was consistent with the inhibition of protein synthesis. HUVECwere stimulated with Ang Ⅱ in the presence of increasing concentrations of rapamycin. 3H-thymidine or 3H- leucine incorporation was measured as described in materials and methods and was expressed as a percentage of the maximal incorporation obtained in the presence of Ang Ⅱ alone

1:control, 2:Ang10-6M,3:Ang10-6M+Rapa10ng/ml,4:Ang10-6M+Rapa100ng/ml

Fig4 Western blot analysis of p7OS6k and ERK2 in cultured HUVEO after stimulation by AngⅡ and rapamycin. AngⅡ significantly increaseed the expression of p7OS6K and ERK2. Rapamycin inhibited the effect of AngⅡ-mediated activation of p7OS6K. *P<0.05 compared with control, #P<0.05 compared with AngⅡ 10-6 M group. (quantification from 3 separate experiments)

2.2 雷帕霉素对HUVEC细胞周期分布的影响 为了研究雷帕霉素抑制HUVEC是否通过阻滞细胞于G1期，我们采用流式细胞术检测。无血清培养基培养细胞48h，G0～G1期细胞占(57.27±6.83)%，血管紧张素Ⅱ10-6M刺激24h后G0～G1期细胞减少至(52.67±5.73)%，S期占(33.83±4.81)%，加用不同浓度雷帕霉素后细胞阻滞于G0～G1期，雷帕霉素100ng/ml组S期细胞明显减少(15.18±0.93) vs (33.83±4.81)(P<0.05)。见表1、图5。

Table1 Effects of different doses of rapamycin on HUVEC cell cycle (n=4)

注：*#P<0.01 between two groups

Fig5 Cell cycle analysis demonstrated that rapamycin caused an accumulation of cells in G1 phase in HUVEC induced by Ang Ⅱ.A:control, B: AngⅡ 10-6M, C: AngⅡ 10-6 M+Rapa10ng/ml, D: AngⅡ 10-6 M+ Rapa 100ng/ml

2.3 雷帕霉素对AngⅡ诱导HUVEC p70S6K，ERK2和细胞周期蛋白表达的影响 我们采用Western blot检测雷帕霉素是否影响血管紧张素Ⅱ诱导的HUVECs的p70S6K，ERK2的表达。实验结果显示，血管紧张素Ⅱ刺激24h后p70S6K，ERK2表达与对照组比较分别增加137%和68%（P<0.05），加用雷帕霉素10ng/ml组和100ng/ml组与单用AngⅡ10-6M组比较p70S6K表达分别下降31%和63%（P<0.05），且雷帕霉素100ng/ml组表达低于对照组，而ERK2的表达在加用不同浓度雷帕霉素均无明显变化。

为了进一步研究雷帕霉素抑制血管紧张素Ⅱ诱导的HUVECs蛋白质和DNA合成机制，我们检测细胞周期蛋白CyclinD1、cyclinA、cyclinB1的表达（图6）。血管紧张素Ⅱ刺激24h后，与对照组比较CyclinD1表达明显增加（P<0.05 ），加用雷帕霉素10ng/ml组和100ng/ml组与单用AngⅡ10-6M组比较CyclinD1表达分别下降80%和90%（P<0.05 ），而cyclinA、cyclinB1的表达在加用不同浓度雷帕霉素均无明显变化。

Fig6 Rapamycin block cyclinD1 protein expression induced by AngⅡ Western blot analysis cyclinD1 protein expression which were stimulated or not with AngⅡ in the presence or absence of 2 concentrations of rapamycin, *P<0.01 compared with control, #P<0.01 compared with AngⅡ10-6 M group. (quantification from 3 separate experiments)

3 讨论

肾素血管紧张素系统（RAS）是一个重要的水电解质平衡调节系统，AngⅡ是RAS中的一种主要生物活性成分。AngⅡ作为一种细胞因子具有调节水钠代谢、血管张力的生理作用，同时AngⅡ又是一种生长因子，刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞的增生。近期研究表明，AngⅡ与其受体结合，活化多条信号通路导致多种细胞活化［4，5］。我们的实验结果也证实AngⅡ刺激血管内皮细胞DNA和蛋白质合成增加，促进血管内皮细胞增殖。本研究主要探讨雷帕霉素对AngⅡ诱导的血管内皮细胞干预作用机制，实验结果显示雷帕霉素抑制p70S6K和CyclinD1的表达及由此导致细胞DNA和蛋白质合成增加，这些结果提示雷帕霉素在抑制AngII诱导的血管内皮细胞DNA、蛋白质合成以及p70S6K信号通路活化中起重要作用。

雷帕霉素是链球菌属丝状菌产生的一种具有抗真菌作用的大环内酯类抗生素［6］近年作为高效的免疫抑制剂应用于临床器官移植的抗排斥反应，更重要的是雷帕霉素在改善移植物的长期存活方面有很好的前景，其机制可能是对与慢性排斥反应有关的重要成分—内皮和血管平滑肌细胞有抑制作用。文献报道，雷帕霉素通过抑制mTOR使细胞周期在G1期被阻断，抑制细胞增殖［7］。

细胞的生长、分化和凋亡过程中，蛋白质合成发挥重要作用［8］，不同的信号调节途径调控蛋白质的合成，提供细胞有丝分裂、细胞分化必须的氨基酸和营养物质，完成细胞器的复制使细胞周期周而复始［9，10］。蛋白质合成最重要的调控因子是丝/苏氨酸激酶—哺乳类雷帕霉素靶分子（mTOR），mTOR调控白的转录、核糖体合成及RNA转运。p70S6K和4EBP1是mTOR的两个主要的靶目标，生长因子、AngⅡ与其受体结合后通过PI3K-p70S6K信号通路活化mTOR激酶，磷酸化p70S6K和4EBP1使其活化，激活蛋白质翻译的启动因子［11］。雷帕霉素发挥免疫抑制作用与mTOR结合形成RPM/FKBP/mTOR复合物。其一通过抑制4EBP1的磷酸化，阻止eIF-4E的释放和转录，其二抑制p70S6K激酶活化，阻遏核糖体蛋白S6磷酸化，减少核糖体/转录蛋白的合成，最终抑制细胞G1期向S期过渡。

调控蛋白质合成的另一重要信号途径为Ras-p42/p44 MAPK。MAPK被称为胞外信号调节激酶（extra cellular signal regulated kinase，ERK），属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，AngII引起MAPK发生酪氨酸磷酸化而使其活化［11］。活化的MAPK有两种形式：p44MAPK(ERK1)和p42MAPK(ERK2)，活化MAPK的途径主要有p21Ras，活化的p21Ras可激活Raf，该信号途径在促进细胞周期进程中极其重要［12］。

我们的实验结果显示，雷帕霉素对AngⅡ诱导的血管内皮细胞DNA和蛋白质合成均呈剂量依赖性抑制，且与抑制p70S6K的表达相一致，但与ERK2的表达无相关性。因为p70S6K能调节一组位于转录起始部位的编码数种细胞器的mRNA，且这组mRNA占mRNA总量的30%［13］，因此P70s6K在细胞由G0/G1进入S期起着关键作用。雷帕霉素通过抑制mTOR阻断PI3K-p70S6K信号通路，抑制血管内皮细胞蛋白质合成，阻滞细胞与G1期。

细胞周期依赖激酶调节细胞周期的进程，FKBP/mTOR调控细胞蛋白质翻译作用可能参与这一过程。雷帕霉素抑制G1期最重要的细胞周期蛋白CyclinD1的合成，阻止白磷酸化，阻断细胞进入S期。流式细胞术的实验结果显示雷帕霉素阻滞血管内皮细胞于G1期，与P70s6K表达降低相一致，即雷帕霉素降低信号蛋白P70s6K的表达，抑制CyclinD1的合成，抑制AngII诱导的血管内皮细胞DNA的合成。

总之，AngII诱导的血管内皮细胞激活两条信号途径：Ras-p42/p44 MAPK及PI3K-p70S6K，导致蛋白质合成关键激酶p42/p44 MAPK和p70S6K活化，雷帕霉素抑制AngII诱导的血管内皮细胞p70S6K活化，抑制CyclinD1的合成，抑制血管内皮细胞的增殖，雷帕霉素对AngII诱导的血管内皮细胞的作用机制可借鉴于临床相关的干预性治疗，阻止病理事件的发生。

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