线粒体缺失与男性不育症

【摘 要】 线粒体是生殖障碍的关键部位和损伤靶点,mtDNA缺陷可能对人类功能障碍的发生具有重要作用。发生过程中,核形态、大小以及染色质状态发生剧烈变化。凋亡常常是以头核的多样性变化而显现的,正是依据核的变化区别和鉴定,用TUNEL染色和瑞-吉染色观察确定凋亡,从而奠定了凋亡形态学分类的依据,创立了新分类方法――凋亡形态分类 。

【关键词】 线粒体; ; 生精细胞; 凋亡; 生殖障碍; 不育症; 靶点

Mitochondria absence and male infertility

CAO Xingwu, LI Cuiying, YUAN Changwei

1 Department of Clinical Laboratory, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

2 Beijing Tongji Hospital, Beijing 100005, China

【Abstract】Mitochondria is the key position and vulnerable target for testicle reproductive dysfunction. The absence of mtDNA might play important role in causing testicle reproductive dysfunction. In the spermatogenesis process, dramatic changes will occur to the shape and size of sperm cores, and to the quality of chromotin. In view of the fact that spermtocyte apoptosis is often manifested by the variety of sperm cores, the apoptotic sperms are determined by TUNEL and Ray-G pigmentation which are used to detect and differentiate the sperm core changes. Based on this, the new sperm typology method is suggested in this paper, namely, the morphological typology of spermatocyte apoptosis.

【Key words】 Mitochondria; Sperm; Spermatogenic cells; Apoptosis; Testicle reproductive dysfunction; Infertility; Target

已经报道,生精障碍是以界膜为靶区(target area),以间质细胞和支持细胞为靶细胞(target cell),以线粒体为靶点(target point)的生理与病理的发病过程[1],而线粒体又是中心环节和关键部位,为此,再就线粒体缺失与不育症予以综述。

1线粒体的生物学

线粒体(mitochondrion)于1850年发现,1898年命名。线粒体由两层膜包被,外膜平滑,内膜向内折叠形成嵴,两层膜之间有腔,线粒体中央是基质。基质内含有与三羧酸循环所需的全部酶类,内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所,有细胞“动力工厂”(powerplant)之称。线粒体有自身的DNA (mitochondria DNA,mtDNA)称为线粒体DNA和遗传体系,但线粒体基因组的基因数量有限,因此,线粒体只是一种半自主性的细胞器。就人类而言,mtDNA是位于细胞核以外的唯一的DNA[2]。

线粒体的形状多种多样,一般呈线状,也有粒状或短线状。线粒体的直径一般在0.5～1.0μm,在长度上变化很大,一般为1.5～3μm,长的可达10μm,人的成纤维细胞的线粒体则更长,可达40μm。不同组织在不同条件下有时会出现体积异常膨大的线粒体,称为巨型线粒体(megamitochondria)。人类mtDNA呈高度扭曲的双股闭环结构,几乎不受DNA结合蛋白(组蛋白)的保护。一个细胞中可含有几个到数百个线粒体,而每个线粒体中往往含有2~10个mtDNA分子,他们有时成簇分布于线粒体基质,并与内膜相连。mtDNA全长为16569bp,分子量约为9~12×10 9,其全部核苷酸序列已经阐明。mtDNA虽然有半自主性复制,但必须与核DNA相互协调才能够发挥作用[2]。

线粒体的基本功能是将外界摄取来的葡萄糖、氨基酸和脂肪,通过位于其内膜上呼吸链的氧化磷酸化作用,来产生细胞活动所需要的能量,并以ATP的形式储存起来[3]。ATP是一切生物进行生命活动的动力,而线粒体是所有真核生物进行能量代谢,产生ATP的重要场所。糖分子在线粒体内通过充分的氧化代谢,所产生的ATP是糖酵解的15倍[4]。正是由于线粒体的这种极高效率的生产能力,生命体才能够在各种激烈的生命活动、复杂的外部环境中向前发展。能量代谢过程中产生的多种自由基分子也参与细胞内的信号传导。

线粒体中不仅存在DNA,而且也有蛋白质合成系统,大多数线粒体蛋白质还是由核DNA编码,在细胞质核糖体合成后进入线粒体。没有细胞核的作用,mtDNA本身不能进行复制。因此,在活细胞内线粒体和细胞核这两个作用不同的遗传系统必须相互协调[5]。mtDNA突变频率比核DNA高10~20倍,其原因:(1)mtDNA分子没有DNA结合蛋白――组蛋白的保护,容易受环境中各种有害物质的伤害。(2)mtDNA中各基因排列紧密,无内含子,某些基因可以相互重叠,几乎每个碱基都用于组建基因。因此,mtDNA的任何突变都可能影响基因组中的重要功能区域而突变率增高。(3)自由基对mtDNA的损害。人类每日耗氧量为2×1020个氧分子/g组织,其中90%由线粒体还原,因此,在氧化磷酸化(OXPHOS)过程以ATP形式提供细胞能量,可以产生大量的超氧化物。(4)线粒体内缺乏完整的DNA修复系统,随着年龄的增加,细胞内mtDNA的突变率将逐渐积累[2]。(5)调节细胞凋亡,氧化压力的增加和能量水平的减少可以激活mtPTP(线粒体通透性转运孔),导致细胞凋亡[6]。

2线粒体与细胞凋亡

线粒体还是细胞程序性死亡的重要参与者和放大者。细胞的各种死亡信号几乎都要传递到线粒体,导致膜通透性增加,储存在膜间隙的多种分子释放到胞浆,包括细胞色素C、AIF(细胞凋亡起始因子)、Smac/Diablo、Endonuclease G(核酸内切酶G)等,这些分子通过活化Caspases(C代表半胱氨酸,Aspase代表天门冬氨酸,其家族蛋白分为三组亚型)或者直接作用于染色体DNA,致使细胞死亡。线粒体是动态的细胞器,在细胞的不同生命过程中以及外界环境刺激下,它的数量和形态都是可变的。线粒体可以有椭圆形、长管状、网络状,不同形状的线粒体由于频繁的融合与分裂,此消彼长,保持在一个动态的平衡之中[7,8]。线粒体融合与分裂过程中必须保证膜结构的完整性,以防止膜间隙分子漏出,导致细胞凋亡。Caspase是细胞凋亡的核心所在。各种引起凋亡的因素,无论是Fas(死亡因子)、肿瘤坏死因子(TN-FRI)、CTL细胞分泌的Granzyme B、Ceramide(神经酰胺,促进凋亡分子)及p53等均需要先激活Caspase才能够导致细胞凋亡[9,10]。

在细胞毒药物诱导细胞凋亡的信号转导途径中,线粒体在促进细胞凋亡信号和Caspases激活之间起着不可替代的作用。线粒体在细胞凋亡中的作用包括:释放Caspases激活因子如Cyto-c(细胞色素-C);丧失电子转移功能并减少能量的产生;线粒体跨膜电位的消失以及与BCL-2(B淋巴细胞瘤/白血病-2)蛋白家族促进凋亡和抑制凋亡功能相关等方面。甚至有人提出线粒体在细胞凋亡中起着决定性的作用。实验证明,γ辐射、Ceramide(凋亡信号转导中的重要分子,介于促进凋亡信号和凋亡过程之间)、Fas与配体结合等均可导致线粒体在电子转移方面功能的紊乱,从而影响呼吸链,ATP产量下降。这种能量代谢上的障碍主要发生在细胞凋亡的晚期。

线粒体在细胞凋亡过程中最重要的一点在于它可释放能够激活Caspases的蛋白。在细胞的体系中,自发的、可以由Bcl-2抑制的染色质聚集和DN段化依赖于线粒体的存在,进而发现实际上是依赖于Cyto-c从线粒体中的释放。从线粒体释放的Cyto-c与Apaf-1(凋亡蛋白酶激活因子-1)、Procaspase 9(半胱天冬酶前体9)结合在一起形成“凋亡体”(Apoptosome),其结果是Caspase 9的激活。除Cyto- c之外,线粒体还可释放其它介导细胞凋亡的分子:Procaspase 3和AIF(Apoptosis-inducing factor)。AIF在体外可作用于Procaspase 3,并且其本身可能就是一个Caspase。

线粒体发生上述改变的机制在于线粒体膜上一种叫PT通道[Permeability transiton pore(通透性转换通道)又叫Megachennal(巨型通道)]的形成。促进凋亡信号会使Caspases激活(某些Caspase的底物就是位于线粒体膜上的蛋白)、胞浆Ca++水平升高、产生Ceramide(神经酰胺),诸如此类的改变会直接或间接地引发PT通道。PT通道是由线粒体一些内膜外膜蛋白组成的,定位于内外膜接触点,并可以无选择性地允许≤1.5kD分子通过。线粒体在细胞凋亡中的重要性还在于它与Bcl-2基因家族之间的关系。实际上,很多Bcl-2家族的蛋白如BCL-2、BAX、BCL-XL等都定位于线粒体膜上。而且实验证实,BCL-2家族蛋白可以影响PT通道开放及其Cyto-c、AIF的释放,还可以改变线粒体外膜的通透性。如BAX一方面可以直接促使线粒体膜内的大小约为12kD的Cyto-c在外膜未被破坏的情况下通过某种通道释放至胞浆;另一方面,又可以激发PT通道的开放。而BCL-2蛋白则起抑制作用。BCL-2高表达也可以减少跨膜电位的下降与细胞凋亡。跨膜电位下降后,线粒体细胞膜的渗透性改变,PT亦发生改变,线粒体内膜渗透性急剧增加,引起线粒体肿胀,细胞膜上的孔或通道增大,使线粒体内的物质外流。孔与通道的开放与关闭受多种因素影响[10]。

这个通道的开放会由于线粒体基质内的高渗透压,使线粒体内外H+梯度消失,呼吸链脱偶连,能量产生中断;还会由于水和溶质的进入使基质肿胀并导致外膜破裂,释放出包括Cyto-c在内的各种活性蛋白。线粒体及Cyto-c在细胞凋亡中的中心地位虽然在不同信号诱导的细胞凋亡中不一定具有普遍意义,但线粒体作为细胞内死亡信号的感受者和放大者在细胞凋亡中的重要性是勿庸置疑的[1]。

线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前,一旦线粒体DYmt崩溃,则细胞凋亡不可逆转[2]。

3 线粒体缺失与男性不育

3.1产生与线粒体DNA的关系

产生需要经过精原细胞的有丝分裂增殖分化为精母细胞,初级精母细胞经过两次成熟分裂,中间度过短暂的次级精母细胞转变为细胞,最后细胞转变成为,一个精原细胞可以产生256个。Hecht[11]对小鼠发生过程中线粒体DNA(mtDNA)分子含量进行研究,发现每个细胞的线粒体含量不同,粗线期精母细胞为300~400个;圆形细胞为150~200个;长形细胞为25~50个;成熟为50~75个mtDNA分子。哺乳动物单个中含有约75个线粒体,因而成熟每个线粒体中只有1个mtDNA分子,在整个发生的过程中,生精细胞内每个线粒体中mtDNA拷贝数目由原来的2~5个减少到1个[2]。

研究表明,一种启动线粒体转录的蛋白质――人线粒体转录因子(human mitochondrial transcription factor , h-mtTFA)可能对人mtDNA拷贝数目具有重要的调节作用。在小鼠mtTFA的同源体(mouse mtTFA,m- mtTFA)编码两种蛋白亚型:细胞核亚型和线粒体亚型,核亚型在体细胞中缺乏,但在生殖细胞中占主导地位,而线粒体亚型在生殖细胞中的含量远比体细胞中低的多。研究提示,mtTFA核亚型的功能可能为特异性转录激活因子或参与核染色质浓缩,另一可能是它在编码核和线粒体mtTFA亚型转录的启动子之间起转录干扰作用[2]。

3.2 活力与线粒体DNA的缺陷

活力是衡量质量和男性生育力的重要指标,活力低下可能导致不育,且大部分活力低下伴随数量减少和畸形率增加,出现寡、弱、畸形症。mtDNA缺陷与活力引起关注。Kao等[12]对21名生育组与19名不育组(其中11例为原发不育;6例为继发不育,少精、弱精各1例)进行mtDNA分析。采用密度梯度离心,获不同层次的活力,测其mtDNA缺失情况,结果发现,mtDNA4977bp缺失与活力呈负相关。正常情况下是通过无氧酵解产生ATP,但在射出后的泳动过程所需要能量中,线粒体呼吸链起重要作用,mtDNA4977bp缺失或其他类型的缺失将导致相应编码蛋白的损害,使OXPHOS发生障碍,运动能力下降,生育力降低。研究证明,弱和少患者的mtDNA缺失比正常人高,原发性不育症患者的缺失率高于继发性不育。其原因可能是寡、弱、畸形症患者产生较多氧自由基和脂质过氧化,并含有大量未成熟。上述结果表明,mtDNA缺陷可能对人类功能障碍的发生具有重要作用[2]。

3.3 形态与线粒体DNA的缺陷

发生期间大约有3/4的精原细胞经历凋亡,预示着整个细胞校对水平的平衡和稳定[13]。作为健康的,维持DNA完整性对未来生殖健康至关重要[14]。DNA损伤出现在始发和成熟期,所以我们在的检测中可以看到凋亡有幼稚型、成熟型和各种各样的凋亡形态,如果凋亡高比例出现,常常是由于DNA高比例的损伤造成的,是不育症的一种原因[15]。所以,凋亡DNA的损伤占据了重要位置,核的浓缩和浓染说明了DNA损伤的结果和表现。中的DNA成分包括两部分,一部分位于头部的核DNA以及位于中部线粒体中的线粒体DNA(mtDNA)。为此我们可以看到头部凋亡和颈中段凋亡的,说明是在这两个部位的DNA损伤造成的结果。核是重要的细胞器,包括父方的遗传物质,在核DNA结合蛋白的组型转换以及核小体结构丢失并最终形成浓缩的核DNA[16]。任何可能的有害刺激因素都可以造成的损伤。Cummins[17]研究发现原发性不育患者中mtDNA共同缺失水平更高,但发现50%正常男性中也有较高水平的mtDNA缺失。因而mtDNA缺陷与男性不育症是否相关尚有争论[17,2]。

发生过程中,核形态、大小以及染色质状态发生剧烈变化。核伸长、染色质浓缩,同时核DNA结合蛋白发生改变。这一系列生物化学事件的发生均伴随核组蛋白取代以及大量核特有蛋白生成,如:tH2, tH2b,Hlt,ssH2B,Hanpl, TPs,Pl,P2。发生过程中组蛋白合成停止,组蛋白被过渡蛋白取代,继而被精白取代。这一过程的完成导致减数分裂后染色体凝缩6倍以上,形成一个过度凝缩的染色质结构[18]。根据凋亡常常是以头核的多样性变化而显现的,正是依据核的变化区别和鉴定,用TUNEL染色和瑞-吉染色观察确定凋亡,从而奠定了凋亡形态学分类的依据。创立了新分类方法――凋亡形态分类与分子机制探讨[19]。

3.4 凋亡率的参考值

凋亡率参考值由于方法不同差异较大。岳焕勋报告[20],采用荧光显微图像测定凋亡,对34份检精者,年龄为33.5岁,中凋亡百分率为6.5%,最大值20.1%,最小值1.3%;坏死为11.8%,最大值30.6%,最小值3.4%。周增娣等采用 AnnexinV荧光染色流式细胞技术检测凋亡率为5.3±2.7%[21]。Riccil等同样技术对正常凋亡检测结果为4.9%±3.3%;坏死为17.8%±8.9[22]。Barroso等[23]检测不育患者结果:凋亡百分率为17%±12%(高活动力);11%±5%(低活动力),其结果显示较大变异范围(最小最大值分别为4%～42%和1%～17%)。刘媛采用[24]瑞-姬氏染色凋亡形态观察,不育组与不育组中的少组凋亡率均明显高于生育组(P0.05)。认为不育组凋亡率高于生育组,尤其是少症患者凋亡率增加更明显。曹兴午等(2006)对不育症伴发精索静脉曲张和无伴发精索静脉曲张患者的凋亡率进行比较,凋亡率分别为19.7%±11.4%和7.8%±3.5%,t检验分别: t=6.39 ;t=-5.53(P

综上所述,生精障碍患者,细胞凋亡不仅可以发生在生精上皮中的生精细胞,也可以发生在支持细胞阶段,更可以发生在形成过程的幼稚期和成熟期以后,其机理都是与线粒体DNA有关。为此,在中不仅进行生精细胞的凋亡率观察,更应进行凋亡形态学分类,对不育症的病因判断有积极意义[29]。

参考文献

1 曹兴午.生精障碍的靶区、靶细胞和靶点[J].中国男科学杂志,2008,22(7):58-60,63.

2 郑 英,沙家豪,周作民,等.线粒体DNA与生殖[J].生殖医学杂志,1998,7(4):242-245.

3 焉传祝.线粒体医学的过去与未来[J].中华内科学杂志,2009,48(4):265-266.

4 Alberts, B. Molecular Biology of the Cell[J]. fourth edition,2002,767-770

5 宋今丹主编.医学细胞生物学[M].北京:人民卫生出版社,1997,106-120.

6 曹莉.人线粒体病[J].医疗装备,2006,(4):35-37.

7 Karbowski M and Youle RJ. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 2003, 10: 870-880.

8 Chen H and Chan DC. Mitochondrial dynamics in mammals[J]. Curr Top Dev Biol, 2004, 59: 119-44.

9 Nagata S.Apoptosis by death factor [J].cell,1997,88:355-356.

10 鲍镇美.细胞凋亡[J].中华泌尿外科杂志,1998,19(12):751-754.

11 Hecht NB,Liem H,Kleeme KC,et al.Maternal inheritance of the mouse mitochondrial genome is not mediated by a loss or gross alteration of the paternal mitochondrial DNA[J].Dev Biol,1984,102:452.-458.

12 Kao SH,Chao HT,Wei YH. Mitochondrial deoxyribonucleic acid 4977bd deletion is associated with diminished fertility and motility of human sperm[J].Biol Reprod.1995,52:729-732.

13 AllanDJ,HarmonBV,KerrJFR,etalCelldeathinspermatogenesis.In:PorterCS,ed.Perspective on mammalian cell death[M]. Oxford, United Kingdom: Oxford University Press,1987,229-58.

14 Aitken RJ,Gordon E,Harkiss D,etal.Relative impact of oxidative stress on the functional competence and genomic integrity of human spermatozoa[J].Biol Reprod,1998,59:1037-46.

15 Shen HM,Chia SE,Oeg CN.Evaluation of oxidative DNA damage in human sperm and its association with male infertility[J].J Andrl,1999,20:718-23.

16 吴永明,夏欣一.DNA完整性检测技术研究进展[J].中华男科学杂志,2006,12(8):737-741.

17 Cummins JM,Jequier AM,Kan R. Molecular biology of human male infertility:links with aging, mitochondrial gentics, and oxidative stress[J]. Mol Reprod Dev,1994,37:345-380.

18 刘媛,凋亡与参数关系及其影响因素初步研究[R].吉林大学,硕士学位论文,2006.

19 曹兴午,曹育爱,邱高辉,等.凋亡分类与分子机制探讨[J].现代检验医学杂志,2009,24(3):1-6.

20 岳焕勋,蒋 敏,李福平,等.人正常中早期凋亡的检测[J].四川医学,2007,28(8):826-827.

21 周增娣,马 丽,葛争鸣,等. 流式细胞技术结合FIIC- AnnexinV/PI荧光染色检测人凋亡[J].中华检验医学杂志,2003,26(10):626-627.

22 Riccil G,Perticararis S,Fragonas E,etal.Apoptosis in human sperm:its correlation with semen quality and presence the presence of leukocytes[J].Human Reprod,2002,17(10):2665-2672.

23 Barroso G,Mohninger S,Analysis of DNA fragmentation ,plasma membrane translocation of phosphatidulserine and oxidative stress in human spermatozoa[J].Hum Reprod,2000,15(6):1338-1344.

24 刘 媛,刘睿智,吴迪,等.少症 、弱症和畸形症患者凋亡率与比较[J].吉林大学学报(医学版),2006,32(5):869-871.

25 曹兴午,王传航,周 强,等.不育症生精细胞凋亡率检测[J].生殖医学杂志,2008,17(5):352-356.

26 Sergerie M,Laforest G,Bujan L,etal.Sperm DNA fragmentation :threshold value in male fertility[J].Hum Reprod,2005 ;20(12):3446-3451

27 谷龙杰,陈振文,许剑锋,等.不育男性染色质结构与常规参数的关系[J].中国男科学杂志,2009,23(3):29-32.

28 董毅飞,王华,罗清炳,等.慢性前列腺炎患者凋亡率的变化[J].中国男科学杂志,2008,22(2):50-52.

29 曹兴午,李翠英,等.线粒体缺失与不育症[J].中国男科学杂志,2010,24:141-142.

[收稿日期:2010-04-05]