RNA干扰下调CD98hc表达对胶质瘤细胞U251增殖、转移的影响

[摘要] 目的 观察下调cd98hc对胶质瘤U251细胞体外增殖、迁移及侵袭的影响。 方法 应用sirna技术干涉U251胶质瘤细胞CD98hc的表达，筛选并获得CD98hc低表达的U251细胞株（U251KD）及阴性对照细胞（U251NC）。流式细胞技术及Western blot鉴定CD98hc的表达下调情况。应用CCK-8细胞增殖实验检测两组细胞增殖；细胞划痕实验及Transwell小室分别检测两组细胞的迁移及侵袭能力；Western blot检测MMP-2、MMP-9的表达。 结果 与阴性对照U251NC组相比，U251KD细胞中CD98hc水平明显下调（P < 0.01），U251KD细胞的增殖和迁移、侵袭能力均显著受抑（P < 0.05），MMP-2、MMP-9的表达也明显降低（P < 0.01）。 结论 下调CD98hc的表达能够明显抑制胶质瘤U251细胞的体外增殖、迁移及侵袭，其机制可能与MMP-2、MMP-9的下调相关。CD98hc分子可作为胶质瘤治疗的一个潜在靶点。

[关键词] CD98分子；胶质瘤；细胞增殖；细胞侵袭

[中图分类号] R730.23 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）06（b）-0016-05

神经胶质瘤是好发于成人的一种原发性中枢神经系统肿瘤，50%以上的胶质瘤具有分化程度低、侵袭性强、恶性程度高等特点，临床预后较差[1]。临床胶质瘤的治疗多采用手术并辅以放/化疗的综合治疗方式[2]，但患者的生存期仍然较短，效果并不理想[3-4]，这主要与胶质瘤复杂的发病机制密切相关。多项研究表明，神经胶质瘤的发生发展是一个涉及多基因、多阶段的过程，因此，阐明其发病的分子机制对胶质瘤的治疗具有重要的指导意义。

CD98分子是由CD98重链（CD98hc、4F2hc）与LAT-1、LAT-2等6种轻链中的一条组成的异源二聚体，在细胞氨基酸代谢转运方面发挥着重要的作用[5]。越来越多的研究发现，CD98hc在多种肿瘤细胞表面呈高表达，与肿瘤的发生发展关系密切[6]。在人脑胶质瘤中CD98hc的表达明显高于正常脑组织，并且其表达水平与胶质瘤的病理分级呈显著正相关[7]。但是CD98hc在胶质瘤发生发展中的具体作用机制目前尚未见报道。本文主要通过干涉CD98hc的表达，观察其对胶质瘤细胞系u251的增殖和运动能力的影响，并初步探讨其机制，旨在为胶质瘤的基因治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

U251细胞株购自中科院细胞库；DMEM（美国Hyclone）；小牛血清（四季青）；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒及CCK-8试剂盒（碧云天生物技术研究所）；Transwell小室（Corning公司）；Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；鼠抗CD98单克隆抗体、鼠抗MMP-2抗体、兔抗MMP-9抗体（Abcam）；抗人β-actin小鼠单克隆抗（Santa Cruz）；羊抗鼠FITC（中杉公司）；二抗（Pierce公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 U251细胞培养于含10% FBS、2% L-谷氨酰胺的DMEM高糖培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱，适时更换培养基和传代。实验时选取处于对数生长期的细胞。

1.2.2 U251细胞转染 取对数生长期的U251细胞2×105接种于6孔板中，继续培养，待融合度达80%左右，按质粒（μg）∶脂质体（μL）=1∶2的比例转染CD98hc-siRNA、空白对照（control siRNA），具体操作按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行，分别获得CD98下调的U251KD细胞株和阴性对照U251NC细胞株。培养48 h后收集细胞进行Western blot和流式细胞技术鉴定，鉴定成功后用于后续实验。

1.2.3 Western blot检测 收集待检测细胞，RIPA裂解提取蛋白，BCA蛋白定量后进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，湿转至PVDF膜后，应用5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，PBST洗膜3次后加入二抗，室温孵育1 h后，洗膜3次，化学发光，采集图像。

1.2.4 流式细胞染色 收集转染后的U251细胞，制成细胞混悬液，浓度为1×106/mL，4%多聚甲醛固定20 min后，1%BSA室温封闭20 min，加入鼠抗CD98单抗室温孵育1 h，PBS洗3次后加入羊抗鼠FITC室温1 h，PBS漂洗后上机检测。

1.2.5 CCK-8检测细胞增殖 收集转染后的U251细胞，每孔1×104个细胞接种于96孔板中，于固定时间点（6、12、24、48、72、96 h）向每孔中分别加入10 μL CCK-8溶液孵育，1 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.2.6 细胞划痕实验 收集细胞，在12孔板中每孔加入4×105个细胞。待细胞贴壁后用中枪头比着直尺呈45°划痕。用无血清培养基洗细胞2次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，分别在培养的0、12、24 h拍照。计算2次拍照间的距离差，实验重复3次，计算平均值。

1.2.7 Transwell侵袭实验 无血清培养基按1∶4稀释Matrigel胶，加入小室上室，每个小室100 μL，37℃孵育4 h。加入细胞前先水化基底膜。消化细胞并计数，浓度为1×105/mL，加入100 μL于小室上室。在小室的下室24孔板内加入400 μL含10%血清的培养基，37℃，5%CO2培养24 h。每组设3个平行复孔。取出小室，弃去培养基，置于未用过的24孔中，95%乙醇固定后加入DAPI染色10 min，10×荧光显微镜下观察，拍照。计数5个视野的穿膜细胞数，实验重复3次，计算平均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Student's t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 U251细胞表面CD98hc的下调表达

Western blot结果显示，U251KD细胞CD98的表达明显下调，蛋白抑制率达56.9%，显著低于阴性对照U251NC细胞（P < 0.001），见图1A；同时，流式结果显示，U251KD细胞表面CD98表达量亦明显低于U251NC细胞（P < 0.001），见图1B。

2.2 下调表达CD98分子抑制U251细胞增殖

应用CCK-8法检测CD98分子对U251细胞的增殖影响，结果发现，U251KD细胞增殖活性与U251NC细胞相比，24 h后两组细胞OD值差异有统计学意义（P < 0.05），见图2。提示CD98分子可显著抑制U251细胞的体外增殖。

2.3 下调表达CD98分子抑制U251细胞迁移

体外细胞划痕实验结果表明，下调CD98的表达后，U251细胞的迁移运动能力明显受抑。U251KD细胞与U251NC细胞相比，在12 h即表现出显著的迁移抑制（P < 0.05），24 h作用更加明显（P < 0.001）。见图3。

2.4 下调表达CD98分子抑制U251细胞侵袭

分别将U251KD细胞与U251NC细胞接种于Transwell小室上室培养24 h，DAPI染色后于显微镜下观察，发现两组均有细胞穿过小室滤膜。U251KD细胞与U251NC细胞相比，穿膜细胞数明显减少，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。提示下调U251细胞的CD98表达对U251细胞的侵袭能力存在一定的抑制作用。见图4。

2.5 下调CD98分子抑制U251细胞MMP-2、MMP-9的表达

进一步收集转染后的U251NC和U251KD细胞，检测其MMP-2和MMP-9表达，结果显示，下调CD98后，胶质瘤细胞MMP-2和MMP-9的表达均明显下调，与阴性对照U251NC细胞相比，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图5。

3 讨论

CD98分子最早被认为是一种淋巴细胞表面抗原，与T细胞和B细胞的激活相关[8]。后来研究发现，CD98广泛表达于除血小板以外的所有细胞，并且在处于增殖状态的正常组织中呈高表达。对增殖活跃的肿瘤细胞而言，CD98分子已被证实高表达于肺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤组织中，这种高表达与患者的病情及预后密切相关[9-11]。在胶质瘤中，也有类似的研究，这些研究提示CD98hc高表达于脑胶质瘤中，而瘤旁组织则无明显表达，并且其高表达与胶质瘤的病理分级和恶性增殖显著相关[12-13]。本研究发现，抑制CD98hc的表达可以明显抑制U251细胞的增殖，这和在其他肿瘤上的研究结果基本一致[14-16]，提示CD98hc在人脑胶质瘤发生和发展中起着重要作用，可作为肿瘤治疗的一个潜在靶点。

侵袭性生长是脑胶质瘤细胞的一个非常显著的特点，这也成为胶质瘤治疗中需要克服的一个瓶颈。本研究发现，下调CD98分子可以显著降低U251细胞的迁移及侵袭能力，进一步分析其具体机制发现，CD98的下调可引起基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的表达降低，提示CD98分子在胶质瘤的侵袭扩散中起到了非常重要的作用。有研究表明，随着胶质瘤恶性程度的增加，MMP-2的表达及活性也明显增加，并与胶质瘤的侵袭直接相关[17]。然而CD98分子如何参与MMPs的表达调控目前还不清楚，笔者推测可能与CD147分子有一定的联系。CD147分子又称为细胞外基质金属蛋白酶诱导剂，可以在肿瘤微环境中诱导MMPs的分泌，从而促进肿瘤侵袭和转移[18]。有文献报道，CD147和CD98hc可能作为一个分子复合体而存在于胞膜表面相互作用，组成CD147-CD98hc复合体进一步调节细胞的糖和氨基酸代谢，从而发挥对细胞的调控作用[19-20]。CD98分子可能通过调控CD147分子的功能进而影响MMPs的分泌，参与胶质瘤细胞的侵袭扩散，至于其具体机制有待于进一步研究。

综上所述，下调胶质瘤U251细胞CD98分子的表达可明显抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，其抑制胶质瘤细胞侵袭的机制可能与MMP-2和MMP-9的表达减少有关。本文从细胞水平证实了CD98分子在脑胶质瘤发生发展中的作用，为以CD98为靶点的胶质瘤基因治疗提供了初步实验依据。

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（收稿日期：2016-03-11 本文编辑：程 铭）