应用于膜片钳实验的脑片制备体会

摘要：目的 探讨应用于膜片钳实验的脑片制备的技术和方法。方法 新鲜脑组织取材，根据实验需要，取相应脑区组织，振动切片机切片。然后放入孵育槽内孵育备用。后在显微镜下观察细胞的形态结构。结果 切片完整，厚薄均匀，脑组织切片细胞活性较高。符合膜片钳实验需求。结论 符合实验需求的脑片，从温度控制、取材、切片等环节都要仔细。

关键词：脑片；膜片钳；电生理

中图分类号：R338.8 文献标识码：A

电生理实验技术是生理学研究中非常重要的实验手段和技术之一，其中脑片电生理实验具有其突出的优点，可以比较直观、快速地观察到脑细胞的放电情况以及药物对它的影响，同时又可以排除在体的复杂因素对其的影响，可以进行长时间的高质量的记录。脑片已被广泛用于中枢神经系统的多种疾病的研究[1]。脑片制备的影响因素很多，为了获得活性良好的脑片标本，本文总结了脑片制备过程中的经验， 为从事相关工作的人员提供一些参考和借鉴。现报道如下[2]。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1实验动物 新生1～2d的Wistar乳大鼠，由沈阳医学院实验动物中心提供。

1.1.2实验试剂及仪器 人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid， ACSF）成分及浓度为（mM）：NaCl（氯化钠）126，KCL（氯化钾）5，NaHCO3（碳酸氢钠）26，CaCl2（氯化钙）2，MgCl2（氯化镁） 2， NaH2PO4（磷酸二氢钠）1.25，Glucose（葡萄糖）10。用氢氧化钠或者稀盐酸调节pH值至7.2～7.4。瞬间粘合剂（502胶）；振动切片机（MA752Motorised Advance Viborslice UK）； 脑片孵育槽；恒温水浴锅。

1.2方法 首先将琼脂块，切割成适宜大小，在振动切片机标本台上涂上少量粘合剂，然后将修整好的琼脂块粘贴在标本台上。制备1000mlACSF，置于冰箱里，温度设置为4℃，然后取500ml烧杯，加入250mlACSF，并通入饱和的混合气体（95%O2+5%CO2），放于恒温水浴锅，将水温设置为36℃。待准备就绪后，开始麻醉动物。

选择出生1～2d的Wistar乳大鼠，用1%戊巴比妥钠（0.5ml/100g）麻醉，迅速断头，小心取出脑组织，剥离脑组织时动作要轻柔准确，切忌挤压脑组织而影响细胞活性，将剥离好的大脑修块，置于持续灌流有饱和混合气（95%O2+5%CO2）的4℃ACSF中，然后取出大脑，平整放于事先置于冰面的倒扣的培养皿上，培养皿上可以放置一张ACSF浸润过的滤纸，用滤纸稍吸干脑组织表面的ACSF，在标本台上涂少量粘合剂，然后将脑组织粘贴在标本台上，振动切片机槽内充以0℃ACSF冰水混合物，以保持低温环境，降低脑组织的代谢率，而且使脑组织具有一定硬度，利于切片，并且持续灌流有饱和混合气（95%O2 +5%CO2）。应用振动切片机切片，根据我们的经验，振动幅度调整为 0.75mm，推进速度为0.18mm/s，根据实验需要，依据图谱，选择切片位置，使刀片与相关脑区解剖位置接近，切取脑片，切片厚度可以选择300μm～400μm之间。应用广口吸管将切好的脑片转移到恒温（36℃）恒速灌流（约3～4ml/min）ACSF的自制的浸入式孵育槽或烧杯中，孵育1h后待用[3]。我们在实验中的体会是，应用切片机切片时标本移动的慢一些，切片机振幅大一些，脑片活性较好。上述操作应控制在30min内结束。

2 结果

脑片活性判断方法：肉眼观察脑片颜色，活性良好的脑片呈淡黄色或粉红色，具有一定的韧性，转移到记录槽后可以自行舒展开；若脑组织颜色发白，韧性差，转移到记录槽后不容易自行舒展开，则说明活性已经丧失[4]。此外，镜下观察：脑片上表面是否出现了干燥现象。如果出现纤维状条纹，表明脑片表面绝大部分细胞已经窒息死亡[2]。健康的神经元表面光滑、轮廓清晰、有立体感，突触结构清楚，当电极尖端压迫细胞膜时可以形成凹陷；若胞浆中有颗粒或可见细胞核，则表明神经元已经受损；死亡的神经元立体感消失， 细胞皱缩或肿胀呈空泡状， 如脑片中活性良好神经元少见或见大片神经元死亡说明脑片活性差[4]。

3 讨论

制备活性良好的脑片是膜片钳电生理实验成功的重要前提之一。本实验室通过大量脑片制备的摸索实践，总结出如下注意事项：一般选择出生1～2d的乳鼠。原因在于，幼年动物颅骨较成年动物软，易于将脑组织顺利取出；幼年动物脑细胞膜韧性好，易于形成高阻封接。整个实验过程中的时间控制，如，取脑动作要迅速、轻柔，时间一般控制在3min内较好[5]。温度控制，ACSF应事先冷冻以降低脑组织氧耗，而且有助于提高脑组织硬度，在0℃冰水混合物中脑组织硬度较好，尤其利于切薄片。给氧： 脑组织接触的全部液体均应为饱和氧混合气体（95%O2、5%CO2）， 以保持恒定的pH值和氧饱和度， 但给氧时气流不应过大，否则气泡直接冲击脑片，会迅速引起大量细胞死亡，需要重新制备脑片[4]。

总之，活性良好的脑片制备有一定的技巧和经验，为了更好地完成脑片膜片钳实验，应多总结经验和技巧，保证

脑片的质量和活性。

参考文献：

[1]刘振伟.实用膜片钳技术[M].北京：军事医学科学出版社，2006：148-149.

[2]杨润生，张彩珠，杨盛昌，等. 脑薄片实验中常见的问题及解决办法[J]. 实验科学与技术，2006，4（4）：71-73.

[3]苏彦欣，苗庆峰，张伟，等. 大麻素anandamide对大鼠海马脑片LTP和海马细胞凋亡的影响[J]. 中国老年学杂志，2006，26（5）：668-671.

[4]夏交，孔维佳，朱云，等. 可视脑片膜片钳技术前庭核团脑片的制备[J]. 听力学及言语疾病杂志，2008，16（5）：424-429.

[5]刘志洋，王会芳，何海斌，等. 探索应用于膜片钳研究的脑片制备方法[J]. 吉林医药学院学报，2013，34（5） ：326-328.编辑/哈涛