DNA碎片率对女性复发性自然流产的影响

【摘要】目的：探讨DNA 碎片率与女性复发性自然流产的关系。方法：收集2013年6月至2013年12月在本中心就诊的发生过2次或2次以上自然流产的患者。将此配偶有不明原因复发性流产史的80例作为实验组；另外选择配偶无流产史的80例作为对照组。分别测定两组男方DAN碎片率。结果：实验组DNA碎片检出阳性32例，对照组DNA碎片检出阳性12例，有统计学差异（P

【关键词】复发性自然流产；DNA 碎片率；染色质扩散法

Influence of sperm DNA fragmentation on recurrent spontaneous abortionCAO Longqiao1， JIANG Yonghui2， WANG Xuesong1， SUN Xiuqin1. 1. Department of Reproductive Medicine， First People’s Hospital of Jining， Jining 272000， China； 2. Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250000， China

【Abstract】Objectives： To study the influence of the rate of sperm DNA fragmentation on recurrent spontaneous abortion. Methods： The samples of patients having had twice or more spontaneous abortion in this center from June 2013 to December 2013 were collected. The 80 patients had unexplained recurrent spontaneous abortions were selected as experimental group while the 80 ones without a history of abortion were chosen as the control group. The sperm DNA fragmentation rate of the two groups was evaluated. Results： There were 32 and 12 cases detected sperm DNA fragmentation positive in the experimental group and control group respectively， with statistically significant difference （P

【Key words】Recurrent spontaneous abortion； Sperm DNA fragmentation； Sperm chromatin dispersion

【中图分类号】R169.4【文献标志码】A

复发性自然流产（recurrent spontaneous abortion， RSA）是指妊娠前20周连续发生2次及2次以上的胚胎停育，在女性中发生率为1%～5%， 其发病机制尚未完全阐明，可能与解剖异常、免疫失调、内分泌紊乱、染色体异常、感染、不良嗜好、血栓形成倾向甚至环境污染和基因多态性等有关。不明确的发病机制给临床治疗带来了困难[1-4]。目前的研究仍然主要集中在女性方面，即使做了详尽的病因筛查，仍有超过40%～60%的病例未找到原因。胚胎的染色体异常或基因异常是导致早期自然流产的主要原因，且流产次数与胚胎染色体或基因异常发生率之间无明显关联。外周血染色体核型分析仅能为8%的自然流产患者找到原因，这表明研究配子阶段的染色体异常或基因异常对于揭示早期自然流产病因或许更有意义[5]。DNA 是遗传物质的载体，近期研究表明DNA的完整性能够影响的受精能力、受精卵的分裂以及胚胎的发育[6-8]。DNA碎片检测采用染色质扩散法（sperm chromatin dispersion， SCD）根据光晕的有无和大小判断DNA碎片化程度，对自然流产和胚胎停育的病因分析具有重要临床意义。

1材料与方法

1.1一般资料

收集2013年6月至2013年12月因胚胎停育来我院生殖医学科进行检查的患者病例，筛选出配偶有RSA的80例男性患者作为实验组。随机选取同时期就诊的有生育要求且配偶无自然流产史的男性80例作为对照组。排除标准：男方生殖器发育不良、严重精索静脉曲张、弱症、少症和死症；女方合并子宫内膜异位、多囊卵巢综合症等其它异常的。两组男、女方年龄和婚龄均无统计学差异。

1.2研究方法

标本采集：嘱受检者禁欲3～7d，身体良好无感冒发烧等情况下法取精。

操作方法：（1）精确配制裂解液；（2）将裂解液置入4℃冰箱中保存14d，使用前1.5h取出，放置22℃室温内；（3）将稀释至5×106/mL；（4）取稀释50uL放置于4℃冰箱中5min；（5）冰箱内取出后将盖玻片移走，将载玻片水平浸入盐酸中变性7min后取出；（6）步骤（5）中取走的载玻片再水平浸入步骤（1）中所述的裂解液中20min；（7）将步骤（6）中的载玻片缓冲液冲洗5min；（8）用乙醇各2min脱水；（9）用瑞氏法或姬姆萨-瑞氏法染，在光学显微镜下观察分析DNA碎片。根据光晕与头部核心直径的比例判断，光晕的直径≥头部核心的1/3为正常，否则为异常即DNA损伤严重，如图1、2所示。本实验将DNA碎片率≥30%作为DNA碎片检出阳性。图1碎片多

图2碎片少

1.3统计学分析

用SPSS 19.0 Windows统计学软件对所得数据进行分析。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，P

2结果

2.1一般情况比较

实验组与对照组比较，男女双方年龄、婚龄、男方禁欲时间均无统计学差异（P>0.05）。见表1。

表1两组资料一般情况组别男方年龄（岁）女方年龄（岁）婚龄（年）禁欲时间（d）实验组

对照组31.29±4.39

32.23±5.1032.11±4.19

31.36±4.655.16±3.29

4.90±3.613.15±1.02

3.42±0.91

2.2DNA碎片检出情况比较

实验组中检出阳性32例，对照组中检出阳性12例，有统计学差异（P

表2两组资料DNA碎片检出情况组别阳性（+）阴性（-）合计实验组

对照组

合计32

12

4448

68

11680

80

160 注： 示 P

3讨论

RSA是指连续发生2次或2次以上的妊娠失败。RSA影响着患者的身心健康，导致婚姻的不稳定。受中国传统思想的影响，有关 RSA 病因学的研究侧重于女性方面，甚至过度治疗，而对男性因素的研究很少。质量通常通过检测密度、活力和形态等常规参数衡量。但这些参数无法反映染色质的改变，而DNA损伤检测则可反映染色质异常[9]。

DNA是遗传信息的载体，DNA的完整性对种族的繁衍具有重要意义，但是生成过程中染色质的浓缩异常、精原细胞的凋亡异常、环境毒物以及不良的生活习惯都会造成DNA损伤。有研究表明DNA碎片率大于30%即认为是不正常的[10，11]，本次研究DNA碎片阳性率在配偶有自然流产史的患者中显著高于对照组，这与Carrel[12]曾经做过的研究结果一致。

本次研究发现实验组DNA碎片阳性率高达40%，这可能与检测方法有关。Bellber[13]认为通过SCD检测，RSA患者DNA碎片阳性率明显升高，而Gil-Villa[14]则认为通过染色质结构分析（sperm chromatin structure assay，SCSA）测定没有发现RSA患者与对照组患者DNA碎片率有明显不同。这些研究结果的不一致性很大程度跟试剂的敏感性和DNA碎片评估的标准不同有关。

DNA碎片对参数的影响和常规实验室对细胞质分析的要求是复杂的，一些学者认为，DNA碎片和参数没有关系[15，16]，然而也有一些学者认为DNA碎片可能对产生不好的影响[17，18]。Ahmadi等[19]研究认为DNA损伤并不影响卵子受精，但影响胚胎的发育潜能。当DNA损伤小于8%时，卵子具有修复DNA损伤的能力，超过这个范围将影响胚胎的发育潜能并导致高的流产率。DNA受损伤严重的，虽然注入卵子内也能使其正常受精、分裂，但胚胎发育至4～8个细胞后，损伤的DNA将诱导胚胎发生凋亡。

综上所述，配偶有过自然流产史的男性患者DNA碎片阳性检出率高于配偶未曾有过自然流产史的患者，这一结果表明DNA碎片率较高可能跟RSA有关。

参考文献

[1]Laird SM， Tuckerman EM， Cork BA， et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage .Hum Reprod Update， 2003， 9（2）：163-174.

[2]Baek KH， Lee EJ， Kim YS. Recurrent pregnancy loss： the key potential mechanisms .Trends Mol Med，2007， 13（7）：310-317.

[3]Elghezal H， Hidar S， Mougou S， et al. Prevalence of chromosomal abnormalities in couples with recurrent miscarriage . Fertil Steril， 2007， 88（3）：721-723.

[4]Rai R， Regan L. Recurrent miscarriage. Lancet， 2006， 368（9535）： 601-611.

[5]Stephenson MD， Awartani KA， Robinson WP. Cytogenetic analysis of miscarriages from couples with recurrent miscarriage：a case control study.Hum Reprod，2002， 17 （2）：446-451.

[6]Ahmadi A， Ng SC. Fertilizing ability of DNA damaged spermatozoa .J Exp Zool， 1999，284（6）：696-704.

[7]Host E， Lindenberg S， Kahn JA， et al. DNA strand breaks in human sperm cells： a comparison between men with normal and oligozoospermic sperm samples .Acta Obstet Gynecol Scand，1999，78（4）：336-339.

[8]Gandini L， Lombardo F， Paoli D， et al. Study of apoptotic DNA fragmentation in human spermatozoa .Hum Reprod，2000，15（4）：830-839.

[9]Sergerie M， LaforestG， Bujan L， et al .Sperm DNA fragmentation： threshold value in male fertility .Hum Reprod， 2005， 20（12）： 3446-3451.

[10]Evenson DP， Wixon R. Clinical aspects of sperm DNA fragmentation detection and male infertility.Theriogenology， 2006， 65（5）：979-991.

[11]Muriel L， Segrelles E， Goyanes V， et al. Structure of human sperm DNA and background damage， analysed by in situ enzymatic treatment and digital image analysis. Mol Hum Reprod，2004，10（3）：203-209.

[12]Carrell DT， Liu L， Peterson CM， et al. Sperm DNA fragmentation is increased in couples with unexplained recurrent pregnancy loss . Arch Androl， 2003， 49（1）：49-55.

[13]Bellver J， Meseguer M， Muriel L， et al. Y chromosome microdeletions， sperm DNA fragmentation and sperm oxidative stress as causes of recurrent spontaneous abortion of unknown etiology. Hum Reprod， 2010， 25（7）：1713-1721.

[14]Gil-Villa AM， Cardona-Maya W， Agarwal A， et al. Assessment of sperm factors possibly involved in early recurrent pregnancy loss. Fertil Steril， 2010，94（4）：1465-1472.

[15]Khalili MA， Aghaie-Maybodi F， Anvari M， et al. Sperm nuclear DNA in ejaculates of fertile and infertile men：correlation with semen parameters. Urol J， 2006， 3（3）：154-159.

[16]Sills ES， Fryman JT， Perloe M， et al. Chromatin fluorescence characteristics and standard semen analysis parameters： correlations observed in andrology testing among 136 males referred for infertility evaluation. J Obstet Gynaecol， 2004， 24（1）：74-77.

[17]Erenpreiss J， Elzanaty S， Giwercman A. Sperm DNA damage in men from infertile couples. Asian J Androl， 2008， 10（5）：786-790.

[18]Muratori M， Marchiani S， Tamburrino L， et al. Nuclear staining identifies two populations of human sperm with different DNA fragmentation extent and relationship with semen parameters. Hum Reprod， 2008， 23（5）：1035-1043.

[19]Ahmadi A， Ng SC. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J Exp Zool， 1999， 284（6）：696-704.

（收稿日期：2015-01-05）