反向遗传操作技术在流感病毒中的应用研究

作者：张钰 罗德炎 王希良 孙建中 【摘要】

反向遗传操作技术（reverse genetics, RG）是近年来比较热门的一门技术，该技术可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造，然后通过拯救病毒的表型变化来判断这些基因操作的效果，从而可以对病毒基因组表达调控机制、病毒致病的分子机理等进行研究. 我们通过对近年来国外有关文献的回顾，希望能够正确看待病毒拯救技术的利弊，注意生物安全性，希望能够为防治可能发生的流感病毒流散和传播提供新的思路.

【关键词】 流感病毒 疫苗 反向遗传技术

0引言

20 世纪人类历史上发生过4 次流感的大流行，对人类健康和生命安全都造成了严重危害. 最近，H5N1高致病性禽流感病毒全世界范围内的肆虐，又引起了世人广泛的恐慌. 疫苗的应用是主要控制和预防这种疾病的手段.但是因为抗原漂移和抗原转变，流感病毒的抗原不断发生变异，这就需要我们安全、稳定、快速的再形成新的疫苗株. 利用反向遗传操作技术，使产生流感病毒完全从克隆的质粒DNA通过8质粒系统，或者改进的少于8质粒系统［1］，再共转染合适的细胞从而快速的得到基因修饰的疫苗候选株. 流感防治的前景在于反向遗传操作技术在研制更有效的流感疫苗中的应用，及对其基因功能的研究.

1禽流感病毒与人流感病毒的关系及感染人的机制

禽流感病毒和人流感病毒都属于流感病毒，只是因为病毒感染的宿主专一性不同而作相应的命名，A, B, C这3型流感病毒中，A型可感染人和禽类，感染禽类的称为禽流感病毒，感染人的称为人流感病毒，而影响宿主专一性的主要因素是病毒的M基因、NP基因和PB2基因等. 禽流感病毒感染人之前，一般需先通过中间宿主完成适应性转变或实现抗原转变，但目前已报道有三类禽流感病毒毒株H5N1, H7N7和H9N2能直接感染人［2］. 其中，只有H5N1可使人发生严重疾病，另外两种病毒的感染不会造成人的严重疾病［3］. 禽流感感染人类机制多数学者认为， 一方面与禽流感结合受体的改变有关，使病毒HA蛋白基因发生突变，主要是从NeuAca2、3Gal受体结合型向NeuAca2， 6Gal受体结合型改变; 这种受体结合的改变是禽流感感染人类的关键步骤; 另一方面，与禽流感自身白结构的改变有关，像H3亚型的禽流感226位的谷胺酰氨突变成亮氨酸后和人类受体的结合能力就将增强［4］. 流感病毒感染人的体细胞后必须进行有效复制， 才能对人体造成损害. 禽流感不能在人的体细胞内进行有效复制， 这主要是与病毒的白(PB1, PB2, PA, NP) 有关， 其中PB2 的组成起决定性作用.

由于流感病毒基因组是8节段负义的RNA，其基因组不具有感染性，各个RNA 片段必须与聚合酶蛋白（PB2, PB1, PA）及白(NP)结合在一起形成核糖白复合物RNPs才有活性. 病毒感染的第一步是与宿主细胞表面的特异性受体HA结合，通过融膜进入细胞后，释放出RNPs，RNPs进入细胞核才开始病毒基因组的复制和转录，每个RN段单独组成一个转录单位，转录出mRNA和互补RNA（cRNA），mRNA翻译合成病毒蛋白，cRNA复制生成病毒负链子代RNA，进而在细胞浆中组装成完整的病毒粒子. HA 在病毒吸附及穿膜过程中以及决定病毒的致病力方面也均起着相当关键的作用，它能否被裂解为HA1和HA2 两部分是病毒感染细胞的先决条件，也是决定病毒致病力的主要因素. 通过核苷酸序列分析表明，毒力突变株要么在HA 裂解位点附近丢失糖基化位点，要么在HA 裂解位点后面获得一个额外的精氨酸. 如HA易于被切割，则毒株具有较高的致病性;反之，则致病力较低［5］. 研究表明HA 可以诱导机体产生中和抗体，是禽流感中最重要的保护性抗原，而且还可以刺激机体产生细胞毒性T 淋巴细胞反应. HA 切割位点的结构是影响其切割性的主要原因，包括位点插入处有多个碱性氨基酸，还有切割位点附近糖基化位点的缺失等，均能使HA 对蛋白切割酶的敏感性增强，从而使病毒致病性提高. 人和禽H5NI流感病毒相比，人H5N1流感病毒的NA柄有19个，从而导致酶活力下降，这种短茎特点是其病毒毒力的决定因素之一［6］. 香港H5N l 毒株中PB2 的第627 位氨基酸产生了由赖氨酸(Lys) 型向谷氨酸(Glu) 型的转化，促使病毒白的合成， 使病毒在体内能有效地进行复制， 导致这种转化的机制可能与组成PB2 的第199 位氨基酸丝氨酸(Ser) 的突变有关［7］. 另外，在病毒的进化过程中，同型A IV 在不同进化种系间发生了基因重组. 这种突变和重组也是决定病毒毒力的因素之一.

2以质粒为基础的反向遗传操作技术在流感中的应用及其发展

反向遗传学是近年来比较热门的一门技术，自1978年第1例RNA病毒Qβ噬菌体的成功拯救以来，各类RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展，这主要归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立和发展. 流感病毒是负链RNA病毒，基因组是支离破碎的. 2006?01据《自然》杂志报道一项电子显微镜研究显示：每个正在发育的流感病毒粒子含有一个遗传材料组成的中心杆，这个中心杆被的杆所包围. 这种高水平的组织可能是决定该病毒感染周期的一个因素，而感染周期可能是新的抗病毒药物的一个作用目标. 而且更主要的是明确了流感内部的结构将加速发展基因递送和表达的效率［7］，从而也为提高病毒拯救效率奠定理论基础. 最初研究人员通过纯化RNPs蛋白，来获得流感病毒；1989年，研究人员通过辅助病毒，获得了流感病毒；1999年，Fodor首次通过12质粒系统拯救出流感病毒； 2005年Hoffmann等［8］建立了使用双向转录表达载体的8质粒系统，在同一个模板（载体上）实现vRNA的转录和病毒蛋白的表达. 在这种表达载体中，把编码vRNA的cDNA正向克隆至polⅡ启动子（从人巨细胞瘤病毒CMV启动子衍化而来）和终止序列（牛生长激素poly（A）信号aⅡBGH）之间，在此表达盒之间还反向插入了人polⅠ启动子（PⅠh）和鼠polⅠ终止序列（tⅠ）. 8个基因片段cDNA分别克隆后转染真核细胞，在同一个模板上由polⅠ控制合成负链vRNA，由polⅡ控制合成正链mRNA并表达蛋白质. 但由于使用同一个模板获得蛋白表达和vRNA合成，又会减小系统的“弹性”，例如，在病毒蛋白和基因传递的研究中，缺少一个或多个片段或者某个（些）片段中存在致死性突变时，就不可能产生病毒样粒子（virus?like particles，VLP）. 然而，适合于生产人类疫苗的细胞系(如Vero细胞)不能够进行高效转染. 为了解决这些问题，Neumann创建了一套少于以PHW2000为载体的经典的8个质粒反基因系统. 在此系统中减少了用于产生病毒的质粒. 八个用于病毒合成的RNA聚合酶I转录盒与一个允许插入大片段外源基因的的PTM克隆载体结合. 同样，两个编码红细胞凝集素和神经氨酸苷酶片段的载体盒和六个编码其他蛋白质的载体盒结合. 另外，将用于表达聚合酶亚基的三个RNA聚合酶II 载体盒和编码NP蛋白载体盒结合. 通过分别组合这些载体盒，显著降低了病毒繁殖所需要的质粒数量，分别形成了3, 4质粒的系统. 生产甲型流感病毒的效率较传统的12质粒系统更高［1］，并且在新一代的细胞培养流感疫苗，此新系统更适合于生产流感病毒疫苗. A型流感病毒不断的发生变异，尤其是已有的研究发现，出现的高致病性人禽流感病毒具有高度变异的特点，需要及时更换疫苗株来确保有效疫苗的制备. RG技术的兴起，开辟了高致病性人禽流感疫苗快速制备新纪元. 通过RG技术快速制备适合中国使用的高致病性人禽流感疫苗株，建立高效拯救流感病毒的技术平台和全面系统的评价体系，从而鉴定合格的疫苗株和血清标准品送WHO确认，为高致病性人禽流感疫苗的制备奠定基础，同时也为应对流感大流行做好技术储备.

3前景展望

反向遗传操作技术发展至今天，载体的选择已经不是什么困难的事情了，关键还在于构建的策略和思路. 随着基因组学和蛋白质组学技术的发展和应用，利用生物信息学技术对微生物基因组序列进行分析，在不需要培养病原体的情况下，从大量的抗原中筛选出研制疫苗的侯选抗原.相对于传统疫苗学，它减少了鉴定疫苗抗原所需的时间和花费，并能提供新的解决方案，对研究新型疫苗也有重要的参考价值［9］. 在拯救技术的日益发展成熟的基础下，反向遗传系统在RNA 病毒功能基因组的研究上也将担当无可替代的作用. 如流感M2蛋白胞浆尾被删去5个或10个氨基酸残基后，就会失去拯救流感病毒的能力；敲除NS2的病毒样颗粒能用作疫苗的载体去表达外源蛋白，可以将其开发为一种复制子载体，以转移外源基因等，都需要通过构造突变或缺失这些序列的人工病毒来阐明其具体功能. 应用RNA 病毒反向遗传系统重现病毒的生活周期和感染模式，对阐明病毒的起源、致病机制和免疫交叉保护提供一种切实可行的方法. 将来可结合感染性克隆对病毒起源和致病性进行调查，开展病毒拯救的机制研究. 直到现在，RNA 病毒的感染性克隆是如何模拟野生病毒感染的具体机理还没有被系统阐明. 另外，尽管多种疫苗已经开发出来且实验室证明其有效的保护作用，但禽流感的发生却没有被消除，这就需要从病毒反向遗传系统延伸到模式生物基因组背景下的“病毒?宿主反向遗传系统”，从而揭示禽流感跨宿主的改变机制是什么，也为预测人类可能流感大流行的病毒株提供依据. 当然也要正确看待病毒拯救技术的利弊，注意生物安全性，防止可能发生的病毒的流散和传播.

【参考文献】

［1］ Neumann G, Fujii K, Kino Y, et al. An improved reverse genetics system for influenza A virus generation and its implications for vaccine production ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(46):16825-16829.

［2］ Shortridge KF, Peiris JS, Guan Y. The next influenza pandemic: lessons from Hong Kong ［J］. J Appl Microbiol, 2003,94 Suppl:70S-79S.

［3］ Baigent SJ, McCauley JW. Influenza type A in humans，mammals and birds: determinants of virus virulence，host?range and interspecies transmission ［J］. Bioessays, 2003,25(7):657-671.

［4］ Sawada T, Hashimoto T, Nakano H, et al. Why does avian influenza A virus hemagglutinin bind to avian receptor stronger than to human receptor? Ab initio fragment molecular orbital studies ［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2006,351(1):40-43.

［5］ Salomon R, Franks J, Govorkova EA, et al. The polymerase complex genes contribute to the high virulence of the human H5N1 influenza virus isolate A/Vietnam/1203/04［J］. J Exp Med, 2006,203(3):689-697.

［6］ Li X, Fang F, Song Y, et al. Essential sequence of influenza neuraminidase DNA to provide protection against lethal viral infection ［J］. DNA Cell Biol, 2006,25(4):197-205.

［7］ Noda T, Sagara H, Yen A, et al. Architecture of ribonucleoprotein complexes in influenza A virus particles ［J］. Nature, 2006,439(7075):490-492.

［8］ Hoffmann E, Neumann G, Kawaoka Y, et al. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000,97(11):6108-6113.

［9］ Obenauer JC, Denson J, Mehta PK, et al. Large?scale sequence analysis of avian influenza isolates ［J］. Science, 2006, 311(5767):1576-1580.