反向遗传技术应用于牛轮状病毒的应用与展望

摘要：为进一步探讨了解牛轮状病毒的生物学特性，分析反向遗传技术在牛轮状病毒中的应用进展，最后再对应用这一技术的未来前景进行初步展望。

关键词：牛轮状病毒；反向遗传技术；应用；展望

中图分类号：R392 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2012）-01-0170-1

牛轮状病毒(Bovine rotavirus，BRV)属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，是引起犊牛急性腹泻的主要病毒之一[1]。发生BRV感染之后多容易继发引起细菌性感染，对犊牛的生命安全和生命质量构成很大的威胁，同时也给养牛业带来巨大的经济损失，对我国养牛业的健康持续发展造成严重的影响。近年来，随着科学技术的不断发展和完善，对牛轮状病毒的生物学研究也越来越完善，反向遗传技术的发展更是准确的提供了获得重组毒株制备疫苗的方法，从而为防治牛轮状病毒提供了更有效的措施。本文通过对牛轮状病毒的生物学、流行病学和其分离培养鉴定等内容的研究，分析反向遗传技术在牛轮状病毒中的应用情况，并展望其未来的发展状态，现将分析报告如下。

1 牛轮状病毒的简介

1.1 牛轮状病毒的生物学特性

轮状病毒属于呼肠孤病毒科(Reoviridase)轮状病毒属，是引起人和动物急性胄肠炎的主要病原体之一[2]。其中A组RV感染是世界范围内导致婴幼儿发生严重腹泻的最主要因素，是发展中国家婴幼儿发生致命性腹泻的首要病因[2]。目前，临床中尚没有治疗轮状病毒感染的特效药物，因此，对其疫苗的研究就成了一直备受关注的课题。BRV是引起犊牛严重腹泻的主要因素，且其致死率较高，有报道表明，英国犊牛因牛轮状病毒而引起腹泻的发生率为60-80%[3]，给养牛业造成严重的经济损失。

BRV呈球形，在透射电子显微镜下呈现出车轮样形状，结构稳定，耐热耐酸耐碱，于20℃左右最为活跃，具有较强的季节性。直径为65～75mm，无囊膜，有3层衣壳，具有双层蛋白壳体。牛轮状病毒为二十面体结构，基因组由双链RNA组成，有11个分节段，一个链编码病毒的6个结构蛋白，另一个链编码6个非结构蛋白，决定了病毒的结构和功能[3]，其中至少会有6个蛋白质要与核糖核酸结合。

1.2 牛轮状病毒的流行情况

全球的科研工作者陆续在猴、猪、狗、禽等多种幼龄动物中发现轮状病毒，逐渐认识到轮状病毒是引起幼龄动物病毒性腹泻的主要病原。随着研究的深入，结合电泳图差异，显示可感染牛的是A、B和C群轮状病毒，其中以A群的感染最为严重[3]。牛群中轮状病毒的感染源主要为粪便，在牛感染病毒后1天便可以在其粪便中检测到病毒的存在。感染病毒主要通过接触、呼吸系统、消化系统途径传播，感染的牛群发生持续性腹泻，进而脱水，短时间内继发大肠杆菌和沙门氏杆菌感染，14-21d后引发肺炎，最终死亡。目前，科学研究者多认为接种疫苗是防御此病的最有效方法，另外，也有些报道表示使用适量的抗生素也可以起到一定缓解细菌性腹泻的作用。

1.3 牛轮状病毒的分离培养和鉴定

轮状病毒分离培养比较困难，应用易感细胞和胰蛋白酶处理是细胞培养分离轮状病毒的关键，最初多采用原代细胞，后来易感细胞系恒河猴肾传代细胞MA-104的引进，成功的分离到适应于细胞培养的多种动物轮状病毒细胞株[4]。牛轮状病毒培养时需要加蛋白水解酶如胰蛋白酶或胰凝乳酶，消化后才能适应细胞，且不需血清。通过VP6高价免疫血清或单克隆抗体建立酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验，检测牛粪便以确定有无感染。VP7或VP4的单克隆抗体可以通过血清学检测确定。

2 反向遗传技术

反向遗传学是指直接从生物的遗传物质来对其生命的本质现象进行阐述。在得到生物体的全部基因序列后人工处理，之后再组成有生命活性的个体。这一技术有利于对生物体功能结构的进一步研究，从而研发新疫苗。反向遗传包括RNA干扰技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等。通过使用反向遗传技术对轮状病毒中的某些重要的蛋白质功能进行鉴定，可以加深对轮状病毒复制和发病机理的研究，从而获得理想的弱毒株。反向遗传技术推动了研究病毒基因组的人工操作和病毒基因功能的进程，具有准确率高、毒力返毒率低等优点，同时其也存在有一定的局限性。然而，目前对轮状病毒疫苗的研究主要集中在实验室VP4、VP6、VP7三个基因阶段，对于安全可靠的应用在临床中还需要得到更有效的发展。

3 展望

牛轮状病毒是引起犊牛急性腹泻的主要病毒之一，也是引起犊牛急性腹泻的最主要病因，感染后容易继发引起细菌性感染，从而引起犊牛死亡。牛轮状病毒主要是通过消化道、呼吸道和接触的方式进行传播，口服或经肠道后，减毒疫苗可激发肠道黏膜免疫，防止肠道黏膜上皮细胞发生感染，因此研制减毒疫苗对于预防BRV感染有着非常重要的意义。目前，国内尚没有成功研制出BRV口服减毒疫苗，传统的筛选毒株效率低，反向遗传技术于基因组水平改良重组，所以将成为获得弱毒株的有效方法。

参考文献

[1] ,宋玲玲,王洪梅.反向遗传技术在牛轮状病毒研究中的应用[J].安徽农业科学,2011,39(12):7255-7257.

[2] 赵雅静,高雪军,刘晨鸣.轮状病毒LLR疫苗株VP7基因的遗传变异研究[J].中国生物制品学杂志,2008,21(12):1074-1079.

[3] 陈军,杨彪,谢金鑫.牛轮状病毒的流行情况及预防措施[J].养殖技术顾问,2011,2:195.

[4] 魏锁成,冯若飞,巩转娣,田风林.牛轮状病毒的分离与细胞培养特性[J].西北民族大学学报,2010,12(31):71-75.

作者介绍：孙素丽（1975-），女，河南正阳人，河南省驻马店市正阳县兰青乡政府农业中心助理畜牧兽医师，研究方向：畜牧兽医。