心肌细胞凋亡影响论文

【摘要目的摘要：观察左旋卡尼汀对心肌缺血/再灌注（MI/R）后心肌细胞凋亡的影响，探索其保护功能的机制.方法摘要：制备家兔MI/R模型，缺血45min，再灌注3h.25只家兔随机分为三组摘要：对照组（Ⅰ组，n=5），MI/R组(Ⅱ组，n=10),左旋卡尼汀治疗组（Ⅲ组，n=10）在缺血后5min静脉注射左旋卡尼汀［1.5mL/（kg%26#12539;h）］.再灌注结束后检测心肌组织SOD活性，原位末端标记(TUNEL)法测定凋亡心肌细胞，免疫组化法测定凋亡相关基因bcl2,fas的表达.结果摘要：MI/R造成明显的心脏功能障碍，缺血区细胞凋亡.SOD活性明显升高，凋亡指数（AI）和Fas含量减少（P%26lt;0.05）,Bcl2含量明显升高（P%26lt;0.05）.结论摘要：左旋卡尼汀具有抗缺血再灌注后心肌损伤的功能，其机制可能是通过调节Bcl2和Fas介导的细胞凋亡而实现.

【左旋卡尼汀；再灌注损伤；心肌缺血；细胞凋亡

0引言

缺血/再灌注（myocardialischemia/reperfusion，MI/R）损伤是冠状动脉再通后一个重要的并发症，也是致死原因之一.有学者提出，细胞凋亡可能为再灌注损伤发病机制中的一个重要环节［1］；通过干预凋亡基因的表达以阻断细胞凋亡过程，从而减轻再灌注损伤能否成为防治再灌注损伤的有效方法已受关注.卡尼汀，又名肉毒碱，可加速脂肪的β氧化，提高三磷酸腺苷（ATP）水平，优化心肌能量代谢途径.近期的大规模临床试验CEMID的结果提示［2］，左旋卡尼汀明显改善心肌梗死后患者的心功能，降低死亡率，缩小梗死面积.卡尼汀探究的新发现［3］，提示卡尼汀在对缺血性心脏病的功能中，优化心肌能量代谢，抑制MI/R心肌细胞凋亡可能是保护缺血再灌注心肌的重要机制.我们通过MI/R模型，探索左旋卡尼汀对MI/R心肌细胞的保护功能及其可能的机制.

1材料和方法

1．1材料

健康家兔25只，雌雄不限，体质量2.5～3.0kg（第四军医大学实验动物中心提供）.卡尼汀（常州三位工业技术探究所研制）；InSituCellDeathDetectionPOD试剂盒德国宝丽曼公司产品；Fas和Bcl2mAb，免疫组化试剂盒（购自北京中山生物有限公司）；伊文兰和氯化三苯基四氮唑（TTC）购自Sigma公司.

1.2方法

1.2.1MI/R模型的制备30g/L戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉，颈部居中切开.分离左侧颈静脉插管连接输液泵.同步记录心电图观察ST变化.心肌MI/R模型参照simpsond的方法加以改进，开胸，暴露心脏,于冠脉左室支中1/2处穿线环绕之,结扎线向外收紧，造成急性心肌缺血，45min后放松结扎线使冠状动脉再通形成再灌注.各组中用以心肌梗死范围和细胞凋亡检测的心脏各半.

1.2.2分组随机分为三组摘要:Ⅰ组空白对照组（n=5）,丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎；Ⅱ组MI/R组（n=10），MI后5min注射生理盐水，至实验结束.Ⅲ组左旋卡尼汀治疗组（n=10），MI后5min注射左旋卡尼汀1.5mL/(kg%26#12539;h).

1.2.3测定SOD含量实验结束后即刻分别取缺血区及正常供血区左心室心肌组织1.0g，低温状态下生理盐水冲洗干净，制成心肌匀浆液，离心后取上清液，按试剂盒说明书操作.

1.2.4细胞凋亡检测及计算凋亡率再灌注3h结束后，分离左心室心肌，取缺血区心肌组织，用100g/L甲醛液固定24h，常规脱水,石蜡包埋，切片，采用末端标记TUNEL法检测心肌细胞凋亡.按照试剂盒说明书操作.每一心脏取3张切片，在高倍镜下（10目镜×40物镜）检测，于凋亡阳性细胞区域随机选择10个视野，对凋亡阳性细胞计数并行计算机图像分析，作半定量测定，以心肌凋亡阳性细胞数占总心肌细胞数的百分比作为心肌细胞凋亡指数（apoptoticindex，AI）.

1.2.5凋亡相关基因蛋白的检测石蜡包埋组织连续切片，用免疫组化SP法观察心肌细胞Fas,Bcl2的表达情况，用HPIAS1000图像分析系统计算A值作为半定量参数，测量Fas,Bcl2蛋白表达.

统计学处理摘要：实验数据用x±s表示，使用SPSS11.0软件，多组比较进行onewayANOVA及LSDt检验，P%26lt;0.05为差异有统计学意义.

2结果

2．1SOD含量（kat/g)变化和I组（0.84±0.42）比较，II组（0.36±0.30）SOD活性明显降低（P%26lt;0.05）,III组（0.72±0.30）SOD活性较II组显著增加（P%26lt;0.05）.

2．2心肌细胞AI变化II组的AI明显高于I组（P%26lt;0.01），III组AI明显低于II组（P%26lt;0.01），但仍高于I组（P%26lt;0.01，表1).

2.3Fas,Bcl2蛋白含量的变化II组Fas含量明显高于I组（P%26lt;0.01），III组Fas含量明显低于II组（P%26lt;0.01）,和I组比较无统计学差异（P%26gt;0.05）.II组Bcl2含量显著低于I组（P%26lt;0.01）和III组（P%26lt;0.01），III组Bcl2含量和I组比较无统计学差异（P%26gt;0.05,表1).表1各组间兔MI/R心肌凋亡指数及Bcl2,Fas含量的比较(略)

3讨论

引起再灌注损伤的主要因素，目前认为和Ca2+超载［3］、氧自由基［4］和白细胞聚积有关.此外，已有多项探究报道显示，氧自由基通过启动Bcl2［5］，TNFα［6］多种细胞凋亡相关因素，诱导细胞发生凋亡.

细胞凋亡是指一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，通过启动内部机制，主要是通过内源性DAN内切酶的激活，导致细胞主动死亡的过程.通过对调控细胞凋亡基因的探究，可以将细胞凋亡相关基因分为诱导基因（死亡基因）和抑制基因（生存基因）.通常在生理条件下，细胞有序而协调的激活凋亡诱导基因（fas,p53等）和/或凋亡抑制基因（bcl2等）共同控制着细胞代谢功能而维持细胞内外环境的动态变化.探究发现摘要：bcl2基因的功能主要是抑制细胞凋亡促进细胞生存.其抗凋亡的机制主要有摘要：Bcl2通过抑制自由基的产生而抑制细胞死亡,Bcl2和Bax结合成杂二聚体，可抑制Bak的促凋亡功能,Bcl2的过度表达有效地阻断细胞色素c由线粒体向细胞质的释放，对线粒体起始的caspase激活机制起着阻碍功能，从而抑制细胞凋亡.Fas又称Apo1即CD95分子，是I型膜蛋白，属肿瘤坏死因子受体家族成员.Fas和活化细胞交联区诱导凋亡的机制主要是通过Fas和FasL结合，诱导神经鞘磷脂酶（SMase）的活化，分解SM生成神经酰氨

（Ceramide,CM）,CM通过膜结合性的丝/苏氨酸激酶等激活第二信使，使胞内Ca2+浓度升高，引发一系列的生化反应，从而激活Ca2+Mg2+依靠性核酸内切酶，引起凋亡.

左旋卡尼汀本身并不是机体的基本营养素，是脂肪酸进入线粒体进行β氧化所必需的辅助因子，可加速转运长链脂肪酸通过线粒体内膜，进入线粒体进行β氧化供能.左旋卡尼汀作为一种有效的氧自由基清除剂，在缓解氧化应激、减少脂质过氧化中均具有明显的保护功能［7］.

本实验我们观察到再灌注早期给予左旋卡尼汀，家兔MI/R过程中SOD活性增加，心肌梗死面积减少，细胞AI下降，Fas蛋白表达减弱，Bcl2蛋白表达增强，表明左旋卡尼汀能抑制MI/R过程中细胞凋亡的发生.提示在MI/R损伤中，细胞凋亡是可以预防的.验证了左旋卡尼汀通过调节Bcl2和Fas抑制心肌细胞凋亡，可能是保护MI/R心肌的重要机制这一假设.

至于左旋卡尼汀抑制MI/R心肌细胞发生凋亡的机制，可能和左旋卡尼汀提高SOD活性，减轻细胞内Ca2+超载，抗缺血，缺氧，减少氧自由基生成、增强细胞抗氧化损伤能力，从而发挥其抗氧化、抗凋亡的细胞保护功能.另外心肌缺血后，脂肪酸，如棕榈酸盐在血浆和心肌组织中生成增多，而棕榈酸盐被认为能促进心肌细胞凋亡［8］，棕榈酸盐通过调控棕榈酰激酶（palmitoy1COA）介导的线粒体膜通透性的变化在细胞凋亡中发挥功能［9］.

【参考文献

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