地塞米松对实验性蛛网膜下腔出血脑脊液中TGF-β1和软脑膜厚度的影响

[摘要] 目的 探讨不同途径早期给予地塞米松对TGF-β1浓度和软脑膜纤维平均厚度的影响。 方法 通过枕大池给自体血建立蛛网膜下腔出血模型，腹腔组及鞘内组分别给予地塞米松。第20天时用ELISA法测脑脊液TGF-β1浓度，用图像分析系统测软脑膜纤维平均厚度。 结果 对照组中TGF-β1浓度及软脑膜纤维平均厚度明显高于腹腔给药组和鞘内给药组；腹腔给药组TGF-β1浓度及软脑膜纤维平均厚度明显高于鞘内给药组。 结论 SAH后早期静脉给予大剂量地塞米松有可能对脑积水的发生有一定预防作用。

[关键词] TGF-β1；软脑膜纤维平均厚度；地塞米松

[中图分类号] R743[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2012）12-0017-03

临床上自发性蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）属于出血性脑血管病比较常见的现象，自发性蛛网膜下腔出血是由于多种原因引起的脑血管破裂，使血液进入蛛网膜下腔所引起的综合征，约占急性脑血管病的15%左右。临床上影响蛛网膜下腔出血预后的主要因素为交通性脑积水及脑血管痉挛等，据报道，SAH继发慢性脑积水的发生率为6%～67%，而其中15.0%～26.3%的患者需行脑室-腹腔分流术[1]。脑积水的发生给患者身心及经济上都带来了二次负担。继发慢性脑积水的发生机制尚不明确。而相关研究表明转化生长因子-β1（TGF-β1）在SAH后脑积水形成中起着重要作用。本实验欲通过不同途径早期给予地塞米松观测其对TGF-β1浓度及软脑膜纤维厚度的影响，进而评定不同途径给予地塞米松对慢性脑积水的预防效果。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

2011年9～11月进行试验，选取由山西医科大学生理实验室提供的2～3月龄，体重250～350 g的雄性Wistar大鼠30只，随机分为3组，每组10只，分别为枕大池给予地塞米松组（鞘内给药组）、腹腔给予地塞米松组（腹腔给药组）、枕大池给予生理盐水对照组（对照组）。在给药后第20天时，分别检测脑脊液中TGF-β1及软脑膜纤维厚度的变化。

1.2 标本制备

将实验大鼠称重后，用10%的水合氯醛以0.3 mL/100 g给予腹腔注射麻醉，待角膜反射消失后，于后颈部及左侧股动脉区备皮，消毒左侧股动脉区，剪开皮肤剥离股动脉备用。然后将大鼠俯卧头低位，消毒，取枕外隆凸以下正中切口约2.0 cm，钝性分离颈部肌肉显露环枕膜，用1 mL注射器针头刺破环枕膜，有突破感后略推进见有脑脊液流出。迅速抽取股动脉动脉血0.2 mL，推入枕大池。拔针后按压3 min。俯卧头低位约30 min。按不同组别分别给予腹腔注射地塞米松1 mg/100 g，鞘内注射地塞米松0.2 mg/100 g，鞘内注射生理盐水0.2 mg/100 g，缝合切口。待麻醉清醒后入笼。72 h后取右侧股动脉重复上述操作。取样前每日对切口消毒。

1.3 标本取材

第20天时用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，取枕外隆凸以下原切口进入，取脑脊液0.15～0.2 mL以2000 r/min离心20 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中待测。迅速将实验大鼠打胸，显露心脏，经左心室插管后，剪开右心耳，用生理盐水冲洗5 min后，灌注10%的甲醛30 min以固定，断头取脑后置于10%的甲醛中固定保存72 h后，石蜡包埋，每份标本经额、顶、枕部冠状以5 μm切片。采用Masson三重染色。用山西医科大学实验室20×10倍光学显微镜下拍片，用图像分析系统测软脑膜纤维平均厚度。用ELISA法测脑脊液TGF-β1浓度。

1.4 统计学分析

各组数据应用（x±s）表示，采用SPSS 13.0软件包进行统计分析。各组之间的比较采用单因素方差分析，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。脑脊液TGF-β1浓度与软脑膜纤维厚度之间关系采用Pearson相关分析法分析。

2 结果

对照组中TGF-β1浓度与软脑膜纤维平均厚度明显高于腹腔给药组和鞘内给药组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。腹腔给药组TGF-β1浓度与软脑膜纤维平均厚度明显高于鞘内给药组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。通过相关性分析Pearson相关系数为0.949，P ＜ 0.01，故可以认为TGF-β1浓度与软脑膜纤维厚度呈直线正相关关系。

3 讨论

脑积水形成后患者可能发生神经功能受损等严重影响生活质量的症状，甚至直接危及生命中枢危害生命，因此对于脑积水的防治有着极其重要的意义。目前自发性SAH后形成慢性脑积水机制尚不明确，广泛认为SAH后在蛛网膜下腔的血细胞及其分解产物刺激产生炎症反应，部分出现过度修复，促进胶原合成、沉积形成纤维化，引起脑膜广泛粘连，使软脑膜增厚，蛛网膜颗粒封闭最终导致脑脊液吸收障碍及循环持续受阻。Sajanti等[2]发现，SAH患者脑脊液中Ⅰ型原胶原和Ⅲ型原胶原明显升高，它们是细胞外基质的主要成分，为绝大多数组织纤维化过程所需物质。随着分子生物学发展，大量研究表明TGF-β1在蛛网膜下腔出血后慢性脑积水的形成过程中起着主要作用。TGF-β1通过刺激胶原基因过度表达及其自分泌和旁分泌方式协调其他因子等多种机制促进细胞增殖和细胞外基质过度沉积，在纤维化过程中起着关键作用[3]。细胞外基质主要成分为胶原，其中85%是Ⅰ型胶原。而TGF-β1对胶原蛋白产生的作用机制很复杂，在转录和翻译水平上，一方面在核因子的参与下，激活Ⅰ型胶原基因的启动子，进一步通过报告基因而刺激胶原及纤维结合蛋白基因的表达，使胶原蛋白合成增加。另一方面，可通过抑制胶原酶表达、增加金属蛋白酶等降解酶抑制因子的合成抑制其分解，从而达到抑制Ⅰ型胶原等细胞外基质的降解。正常人脑脊液中不含或含极少量TGF-β1，且表达程度极低。蛛网膜下腔出血后血小板、胶质细胞、星形细胞、蛛网膜细胞和炎症反应等均可释放大量的TGF-β1进入脑脊液。Flood等[4]发现SAH后脑脊液中TGF-β1的浓度呈现两个时相的升高，即早期的普遍表达和后期与损伤有关表达。在出血24 h后即出现第一时相的升高，估计与脑脊液中出现的大量的血小板释放有关，后TGF-β1迅速降解。第二时相于SAH后第10天出现并持续高水平表达至第19天，预计与自身激活以自分泌释放和各种刺激下激活血管内皮细胞、巨噬细胞等释放有关。TGF-β1是与组织纤维化密切相关的细胞因子，其各组织间纤维化过程相近。在外周的研究中显示如果TGF-β1持续过度增高就可引起组织纤维化，所以第二时相的持续高水平表达有可能与SAH后慢性脑积水的发生密切相关。TGF-β1除可在转录和翻译水平刺激胶原蛋白过度沉积，还可促进纤维连接蛋白、透明质酸等在细胞外基质的沉积，促进纤维化。TGF-β1的过度表达促进软脑膜细胞和成纤维细胞的增殖，促进细胞外基质沉积，导致软脑膜纤维增厚、蛛网膜下腔狭窄等病理过程，进而引起正常的脑脊液通路受阻或吸收障碍引发脑水肿。Motohashi等还发现TGF-β1能促使软脑膜细胞增殖，具有刺激脑脊液增多的作用[5]。

地塞米松作为肾上腺皮质激素类药有广泛的抗炎及免疫抑制作用，具有减轻和防止组织对炎症的反应，能抑制胶原蛋白合成并促进分解，抑制结缔组织的增生，降低细胞壁和毛细血管壁的通透性，降低其炎性渗出。在基因水平的调节，传统观点认为糖皮质类固醇激素的抗炎作用主要是通过与糖皮质类固醇激素受体结合后增强抗炎基因或抑制炎症基因的转录而实现的[6]。地塞米松作为主要的抗纤维化药物之一，广泛应用于抗外周纤维化疾病中而在中枢系统的应用尚较局限。因TGF-β1在致纤维化的病理过程中为起主导作用的关键因子，从而推测地塞米松可能通过抑制TGF-β1途径来防止纤维性疾病的进展，从而能够防止软脑膜增厚。李彤等[7]研究发现地塞米松对SAH后蛛网膜下腔炎性反应有抑制作用，且其抑制程度与药物的局部浓度有关。相关研究显示，在转录水平上地塞米松抗纤维化作用不仅表现为能直接抑制胶原基因的启动转录而且能拮抗TGF-β1的致纤维化作用[8]。根据许多文献报道表明糖皮质激素对已经形成的纤维化作用不明显。

目前大量相关研究显示早期鞘内给予地塞米松能有效防治脑积水，对于静脉给药预防脑积水却鲜有报道。但是我们在临床上对于SAH的患者往往存在禁忌或难以操作，尤其是对于动脉瘤性SAH有诱发再次出血的可能。本实验结果提示大剂量静脉给予地塞米松有可能对于临床上脑积水的预防有一定效果。但是大剂量应用地塞米松有一定副作用。在Urbach的研究中，也发现引起钙离子浓度下降的地塞米松的浓度为10-9 mol/L，和以往报道的＞10-4 mol/L不符[9]。这也许可以让我们减少大剂量激素治疗时所需的剂量，且仍可产生相同的作用效果，同时又可以减少副反应的发生。当然这有待于我们进一步研究。