马铃薯茎尖脱毒培养技术研究

摘要：马铃薯茎尖脱毒是解决当下马铃薯产量和品质下降的主要措施之一。本文主要介绍了茎尖脱毒的原理和方法，同时对影响脱毒效果的因素进行了详细分析，进一步阐述了对病毒检测的常用方法。

关键词：马铃薯；茎尖脱毒；病毒检测

中图分类号： S532 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2013）-10-23-2

马铃薯是我国重要的粮食作物，近年来，政府加大力度发展现代马铃薯产业，促进了马铃薯产业的快速发展，种植面积和鲜薯产量均居世界首位，产业链条逐步拓展，经济效益稳步提升。但是，马铃薯是通过块茎进行的无性繁殖，在连年种植过程中土壤和种薯本身携带的病害逐年严重，导致品种退化，严重降低了马铃薯的产量和品质。1955年法国Monel通过剥离马铃薯茎尖获得了不带病毒的马铃薯脱毒苗，引起了科学界的广泛关注，世界各地纷纷采用马铃薯茎尖脱毒快繁应用于大田生产，提高马铃薯产量，改善其品质。

1 马铃薯茎尖脱毒原理

对于马铃薯来说，茎尖分生组织中维管系统还没有完全发育好，病毒转移只能依靠刚形成的少量胞间连丝进行，这样病毒的传播速度特别低，同时由于胞间连丝中的运动蛋白与病毒若不能形成特殊结构的，病毒亦不能转运；所以，越接近茎尖的部位病毒含量越低，组培后获得无毒苗的几率也较大；另外病毒在植物体内分布是不均匀的，越接近生长点0.1～1mm区域，病毒浓度越稀，因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。

马铃薯茎尖脱毒就是利用该原理，把茎尖剥离接种到培养基上，进而培养马铃薯种薯或微型薯。

2 操作方法

剪取促芽后的马铃薯块茎上合适大小的芽若干个，冲洗干净后放于烧杯内用纱布封口，置于自来水下反复冲洗40分钟，吸干表面水分放进超净工作台进行深层消毒；先用75%酒精浸泡20～45s，无菌水冲洗3次；再用0.1%的升汞浸泡8～10min，无菌水冲洗5次，冲洗时轻轻晃动烧杯时消毒剂彻底被漂洗掉，之后置于无菌滤纸待用。

在40X解剖镜下剥离茎尖，一手用镊子将芽按住，一手用无菌解剖针将叶片逐层剥掉，直至露出圆滑的生长点，用解剖针切取带1～2 个叶原基的0.3mm茎尖，接种到培养瓶内，保证切面接触培养基；同时在剥离过程中，操作要敏捷准确，防止茎尖在空气中暴露时间长，水分蒸发使茎尖变干；将接种的培养瓶置于培养箱进行培养，定期观察其生长状态和污染情况。

3 茎尖脱毒的影响因素

3.1 外植体材料

外植体材料的大小会影响脱毒效果。相对较小的茎尖，携带的病毒量很少或几乎没有，但是茎尖太小成苗率很低，也不利于获得大量脱毒苗；有研究表明[6]，脱毒过程中一般剪取0.1～0. 5mm，带1～2 个叶原基的茎尖，既能提高成活率，又能排除大多数病毒；在芽的选择上顶芽比腋芽好，生长旺盛季节的芽比休眠芽或快进入休眠的芽的脱毒效果好，而且成活率也高。[2]也有试验证明，只被单一病毒如PVX感染的植株脱毒较容易，而复合浸染的植株（如PVX和PLRV）脱毒较难。

3.2 培养基配方

不同类型的培养基对茎尖能否脱毒和成活有重要影响，且添加不同的激素亦能促其成活。目前在马铃薯茎尖脱毒培养中常用的是在MS培养基的基础上添加不同浓度的激素，王娟等人的研究发现添加生长素NAA的效果要比细胞分裂素6-BA的效果好。[1]同时在培养基中加大K+和NH4+的浓度对茎尖生长和发育有重要作用，在一定程度上可提高脱毒效果。[3]通过对蒙薯进行研究，在茎尖培养基中，添加少量的Vc可抑制褐化，提高成活率。

3.3 培养条件

温度要求室温在18℃～25℃，光照2 000～3 000 lx，光照时间每天14～16 h，相对湿度70%～80%[4]，培养两周后，茎尖生长点明显变大变绿；30～40 d后，会看到茎尖明显伸长，叶原基形成可见的小叶[5]，此时需转到相同培养基或MS 培养基中，小苗继续生长，并形成根系，100天左右后发育成3～4个叶片的小植株，再将其按单节切段，进行扩繁，成苗后，用于病毒检测。

4 病毒鉴定

通过上述方法获得的组培苗，第一次扩繁之后必须进行严格的病毒检测，保证获得的确实是脱毒苗。目前常用的方法有指示植物鉴定法、抗血清鉴定法[6]；但是因马铃薯病毒种类多且株系及宿主品种不同，仅根据外观症状判断是否脱毒，容易出现误差；随着分子生物学技术的发展，目前该技术已应用到马铃薯病毒鉴定中。经病毒检测后，确认是不带病毒的株系，才能进一步利用，带毒株系应淘汰或进行再次脱毒。[6]

4.1 指示植物鉴定法

在马铃薯的病毒鉴定中，汁液鉴定是最常用的方法。将待测马铃薯苗的汁液接种到指示植物上，若指示植物没有出现该种病毒导致的常见症状，可初步判断该苗可能不带毒，还需进一步鉴定。如X病毒、S病毒和纺锤块状病毒很容易通过汁液来接种。但是这种方法不能定量而只能定性，同时由于受接种方式、发病条件的影响，使鉴定结果出现一些误差。

4.2 免疫双扩散

这是在半固体的凝胶中测定在其中扩散的抗原和抗体间的沉淀的方法，有扩散沉淀表明是带毒植株，无沉淀是脱毒苗；是一种广泛使用的马铃薯脱毒的血清学鉴定方法；该法提高了马铃薯病毒病检测的灵敏度和特异性，并且对汁液无需特殊处理。

4.3 分子生物学鉴定

目前用于马铃薯病毒检测的分子生物学技术主要有：RT-PCR检测技术、指示分子NASBA检测技术、核酸杂交检测技术三大类，以RT-PCR技术应用最为广泛。另外病毒外壳蛋白基因的克隆与表达、DNA介导的抗体制备及病毒单链抗体片段筛选等技术在马铃薯病毒免疫学检测技术中也有成功的应用，并解决了传统免疫学方法难以解决的抗原制备问题。[7]时妍等根据马铃薯四种病毒的基因序列设计合成了PVY、PVA、PVS和PLRV的特异性引物，进行RT-PCR扩增，建立了该四种病毒的常规RT-PCR检测技术，并优化了此法中涉及的RNA提取方法。该法操作简便、检测快速，且同时对大量样品鉴定。[8]朱云芬等将免疫法与RT-PCR法结合起来可快速准确的检测PVY。[9]目前RT-PCR中用到的试剂盒也商品化，为脱毒薯的鉴定提供了更便利的条件。

5 小结

目前，马铃薯脱毒快繁体系已取得了令人瞩目的成就。但是，马铃薯各种病毒在不同地区分布差异较大，各地危害马铃薯的主要病毒和类病毒是目前研究的主要课题；此外马铃薯茎尖脱毒的成功与否受多种因素制约，如何在减少人力和物力的基础上提高成活率，并且把脱毒效果和范围进一步发展还需深入研究。各地区应该加快脱毒与快繁技术集成化、产业化、优质高产高效化，不断完善各项技术才能进一步推动马铃薯茎尖脱毒体系的发展，促进当地农民增产增收。

参考文献

[1] 王娟，汪仲敏，王瑞英.马铃薯茎尖脱毒培养影响影响因素研究[J].中国马铃薯，第24 卷，第3 期，2010.

[2] 毛玮，王英，金建钧，刘志文.马铃薯茎尖脱毒体系研究进展[J].安徽农业科学， Journal of Anhui Agri Sci 2009， 37（ 33） ： 16257- 16260.

[3] 安颖蔚，孟令文，张辉.马铃薯脱毒及微型薯繁育技术体系的研究与应用[J].杂粮作物，2006，26（ 3）：197-199.

[4] 齐恩芳，王一航，张武等.马铃薯茎尖培养方法优化研究[J].中国马铃薯， 2007，21（4）：200-202.

[5] KATARZYNA L J， MARK K， NAKHLA C. Multiplex detection of potato virus S， potato virus X， and potato virus Y by nor radio active nucleic acid spot hybridization in potato t issue culture plantlets [J].American Journal of Potato Research，2006，83（6）：495-501.

[6] EMMANUEL J， TRIBODETA F， VALER IE B. A single nucleotide polymorphism based technique for specific characterization of YO and YN isolates of potato virus Y （PVY） [J].Journal of Virological Methods， 2005，125：83-93.

[7] 吴兴泉，刘晓磊，陈士华等.山西省马铃薯Y病毒cp基因的克隆[J].安徽农业科学，2009，22（1）：9-11.

[8] 时妍，吴兴泉等.马铃薯病毒快速检测技术的建立与应用.河南工业大学， 2012（05）.

[9] 朱云芬，程群.沈艳芬等.免疫试纸条结合RT-PCR法快速检测马铃薯Y病毒[J].湖北农业科学，2011（05）.

作者简介：张海霞，内蒙古呼和浩特人，呼和浩特职业学院生物化学工程学院讲师。