丹参诱导干细胞分化的研究进展

中图分类号：R392.5 R289.5　文献标识码：A　文章编号：1672－1349(2007)08－0721－02

干细胞能产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，形成人体多种组织器官的祖细胞。既具有生理性的更新能力，又具有对损伤疾病导致的修复功能。干细胞归巢于新的组织后，在局部组织微环境的作用下定向分化为相应组织的成熟细胞，实现组织的更新和修复。丹参具有活血化瘀、理气止痛的功效。近年许多实验证实丹参在诱导干细胞增殖和分化上显示出巨大的潜力，选择性采用神经干细胞标志物巢蛋白(Nestin)、神经元标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、βⅢ微管蛋白(βⅢTubul{n)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)进行鉴定，结果显示阳性，表明中医药在干细胞研究的道路上迈出了新的一步。

1　干细胞的概念及生物学特性

干细胞(stem cell，SC)是一类具有自我更新和多向分化增殖潜能的原始细胞，能产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，形成人体多种组织器官的祖细胞。既具有生理性的更新能力，又具有对损伤疾病导致的修复功能。目前公认的干细胞应具备的几点主要细胞生物学特点有：①具有自我更新能力与维持能力，也就是说它可以分裂，分裂后的子细胞与母细胞一样保持其原有的各种细胞生物学特性，而且还可以不断地分裂下去。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自我更新能力，不同于那些有限自我更新能力的祖细胞。这对于维持机体组织器官的稳定性有很重要的意义；②具有多向分化的能力(多能性或全能性)，可以分化发育成各种胚层组织的细胞，或可以分化成为本系统各谱系的细胞(特定组织干细胞，如造血干细胞)；③既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应与修复能力，如骨髓间充质干细胞等；④干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境(nitches)，也就是说干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将胚胎细胞种植人小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。

2　干细胞的分类

干细胞存在于早期的胚胎、骨髓、脐血和部分成年人的细胞中。在一定条件下可以分化为多种功能细胞。

2．1 按分化潜能的大小分类可分为3种：一是全能性干细胞，它具有分化成人体内各种细胞的潜能，如胚胎干细胞；另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可以分化出至少12种血细胞，还可以分化出造血系统以外的其他细胞；还有一类为单能干细胞(也称专能、偏能干细胞)，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的肌原细胞或叫卫星细胞。

2．2 根据干细胞生存阶段分类可以分为胚胎干细胞和成体干细胞两类。胚胎干细胞是来源于哺乳动物早期胚胎内细胞团中的一种二倍体细胞，一般可从植入子宫内膜前的囊胚中分离出来。这种细胞是能在体外培养的一种高度未分化细胞，具有全能性或多向性分化潜能。它们能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层的各种分化细胞。它们的基本特性是具有发育的全能性，即具有分化成为机体内任何一部分组织和器官的能力，因而有人称之为“万能”细胞。美国的威斯康星大学的Thomson等和霍普金斯大学的Gearhart实验小组分别报道用不同材料、不同方法成功地分离并建立具有多向分化潜能和永久生殖能力的胚胎干细胞(ES)细胞系和畸胎瘤干细胞(Ec)细胞系。研究模型的解决，为人类的健康和现代生命科学的发展、研究开创了一个新时期。成体干细胞也称为特定组织干细胞，多能干细胞继续向前分化则成为定向祖细胞(committed progenitor)，持续停留在某种组织中，被称为特定组织干细胞。它们在特定的条件下，可以对称地分裂为2个新的子代干细胞或2个功能细胞，也可以不对称地分裂成1个子代干细胞和1个功能干细胞，从而使组织分化与器官保持生长和衰退的动态平衡。它们具有自我更新和产生本系统后续细胞的增殖细胞，如造血干细胞(hernatopoietic stem cell，HSC)、骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cdt，MSC)、神经干细胞(neural stem cdl，NSC)、肌肉干细胞、表皮层干细胞、肝干细胞，最近我国已成功培养心肌干细胞等。传统的观点曾认为成体干细胞的分化潜能较弱，只能分化成与其组织来源一致的某种特定的组织细胞。然而在某些情况下，干细胞的分化并不遵循这一规律。在实验中分离出小鼠的肌肉干细胞，经过体外培养7 d后，将它与小量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化成为各种造血干细胞系。这种现象被称为干细胞的可分化性H]。迄今对成体干细胞研究较多的是造血干细胞和骨髓间充质干细胞；其次神经干细胞的研究也较多，以及成肌干细胞和皮肤干细胞。也许是人们渴望找到一种对于神经系统退行性疾病的有效治疗方法，近年来对于神经干细胞的研究颇多也颇深入，并且已经有实验表明神经干细胞的移植可以治愈帕金森病。事实上可能各种成体组织中均含有分裂能力的干细胞。当组织受到外伤、老化、疾病等损伤时，这些细胞就增殖分化产生新的组织来代替，以保持机体平衡。

3　丹参与千细胞的相关实践基础

干细胞归巢于新的组织后，在局部组织微环境的作用下定向分化为相应组织的成熟细胞，才能实现组织的更新和修复。关于干细胞分化的调控机制目前还不十分清楚，大多数的观点认为与微环境的调控密切相关。干细胞通过与邻近细胞、细胞基质和细胞因子的相互作用，而影响其分化进程。丹参(Slvia miltiorhiza Bge)在临床广泛应用于心、脑、肝缺血／再灌注损伤的保护、调节免疫应答、抗感染等，其在诱导干细胞增殖和分化上亦显示出巨大的潜力。其成分包括：丹参酮I、IIA、IIB、隐丹参酮、二氢丹参酮、原儿茶醛、丹参素等。丹参注射液具有活血化瘀、理气止痛的功效，是临床治疗冠心病、心绞痛的常用中药。近年发现丹参注射液有细胞诱导作用，孟凡刚等用丹参诱导成年小鼠骨髓基质干细胞，分别于诱导后5h，24h，72h进行免疫细胞化学染色，结果显示巢蛋白(Nesfin)和βⅢ一微管-蛋白(BⅢTubulin)均呈阳性表达。杨立业等用丹参注射液诱导鼠间充质于细胞分化为神经样细胞。项鹏等用丹参注射液诱导成人骨髓间质干细胞，为进一步确定MSC是否分化为神经元，采用神经元标志物神经元特异性烯醇化酶、NF、神经干细胞标志物巢蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAD)进行鉴定。结果显示，丹参诱导5h后，多数细胞表现为NSE阳性，棕黄色染色，细胞形态多样，出现简单的双极细胞和复杂的多极细胞。NF是神经元特异性中间纤维，是神经元胞质主要结构之一，NF免疫组化结果与NSE类似，部分细胞体与突触皆为阳性。诱导5h后多数细胞巢蛋白染色阳性，证明该细胞具有神经干细胞。GFAP免疫组化染色显示无阳性细胞，证明本研究诱导MSC分化为神经元而非星形胶质细胞。马廉等用丹参注射液诱导人的脐血MSCs后细胞形态发生明显改变，细胞表达3类神经细胞的相关标记，少量细胞表达神经干细胞标记兔抗巢蛋白抗体，40％－50％细胞表达神经元标记鼠抗BⅢ微管蛋白和鼠抗神经微丝抗体。余氏等已经证实丹参素、丹参酮可在体外成功诱导人MSC为神经元样细胞。Nestin，NSE，NF-M染色呈强阳性(棕黄色)，而未分化的MsC为阴性(蓝色)。原清涛等用隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞行神经元标志物NSE，NF的鉴定，结果显示，用隐丹参酮诱导的细胞可以呈现NSE，NF阳性，证明已经诱导为神经元样细胞。夏文杰等用隐丹参酮诱导成人骨髓间质干细胞，结果显示隐丹参酮诱导5h后，大多数细胞Nestin阳性，7h后多数细胞NSE染色阳性部分神经元拉成网状，诱导5d后NF－H染色阳性。

4　小结与展望

源于胚胎组织的神经干细胞曾被认为是治疗中枢神经系统疾病的希望，但它的利用因来源的缺乏和伦理道德的约束受到明显的限制。目前使用的神经干细胞大多数来源于鼠，而鼠与人之间存在着明显的种属差别，骨髓间质干细胞和脐血干细胞因其来源丰富、采集容易而备受医学研究者们青睐。神经干细胞的诱导、分化和进一步迁移的机制有待进一步研究。

丹参及其制剂有活血化瘀、安神宁心、止痛等功效。其在诱导干细胞增殖和分化上显示出巨大的潜力，随着研究的深入和科技手段的进步，有望探索出一条全新的对干细胞进行诱导分化的干预调节体系，使中医药在干细胞研究的道路上迈出崭薪的一步。一方面可望将干细胞用于创伤修复、神经再生和抗衰老等临床医学研究，另一方面利用干细胞再造组织和器官，神经系统疾病的治疗亦可进入一个崭新的领域。