FHIT对急性髓系白血病细胞的影响

1真核表达质粒pEGFP－FHIT的鉴定

对所构建的质粒进行PCR检测，PCR扩增出480bp片段；内切酶图谱鉴定。酶切结果显示：480bpFHIT和4kb两条片段（图1）；序列分析：DNA测序结果与GenBank比较，核酸序列一致。

2pEGFP－FHIT转染HL60细胞

转染48h后实验组pEGFP－FHIT／HL60（图中命名为pFHIT组）及对照组pEGFP／HL60（图中命名为Control组）用荧光显微镜观察，均见绿色荧光蛋白表达，两组绿色荧光强度无明显差异，空白对照组（图中命名为Wildtype组）HL60无荧光表达（图2）。实验组计算载体转染率为40％。

3RT－PCR检测FHITmRNA的表达

转染后24h，进行FHIT基因的PCR扩增，扩增产物为480bp，实验组（pFHIT）显示明显亮度的条带，与对照组相比，说明转染成功，β－actin作为内对照（图3）。

4Westernblot检测FHIT蛋白的表达

转染后48h，进行Westernblot实验，实验组显示产物蛋白为16．8kD，与目的基因FHIT蛋白大小一致，β－actin作为内对照（图4）。

5MTT检测细胞增殖情况

转染FHIT基因后，实验组细胞增殖抑制率6天分别为8％、25％、41％、62％、70％、75％，与对照组相比具有显著性差异（P＜0．05，图5）。

6流式细胞仪检测细胞凋亡

转染48h进行流式细胞仪检测，结果显示：实验组凋亡指数高于对照组。实验组凋亡率（25．25±0．27）％，与对照组凋亡率（5．31±0．31）％相比，具有统计学意义（P＜0．05，图6）。

7讨论

急性白血病是致死率高的恶性肿瘤之一，急性髓系白血病（acutemeoloidleukemia，AML）在我国最为多见。目前，联合化疗依然是AML最基础和主要的治疗手段，但大部分患者仍旧复发，超过70％的患者最终死亡。随着生物技术的发展，基因治疗迅猛发展。肿瘤的发生往往与体内基因的异常表达密切相关，FHIT基因在急性髓系白血病中的异常表达为白血病的基因治疗提供了可能。FHIT基因位于染色体3p14．2区域内，外显子5－9开放性阅读框编码一个由147个氨基酸组成的相对分子质量为16800的蛋白即FHIT蛋白。FHIT基因几乎存在于所有正常组织，主要通过参与细胞周期的调控和凋亡发挥作用，可使细胞受阻于增殖周期的S期，并激活Caspases8和Caspases9从而引起Caspase酶介导的凋亡级联反应［4］。FHIT基因位于人类基因组最常见脆性位点，其基因异常与许多肿瘤有关，是肿瘤发生发展过程中的早期事件［5－6］。FHIT在人体肿瘤中主要的异常形式是杂合性缺失（lossofheterozygous，LOH）和FHIT蛋白表达的减少或缺失［7］。白血病中也存在FHIT基因的转录异常和FHIT蛋白的缺失或低表达［1］，但FHIT在白血病发生发展中的作用机制还不很清楚。我们首先克隆FHIT基因，成功构建了pEGF／FHIT真核表达载体，经测序鉴定后成功转染到FHIT基因异常表达的急性髓系白血病细胞系HL60中，转染48h后荧光显微镜下见绿色荧光表达，表明载体转染成功。转染后细胞的PCR及Westernblot进一步证明了FHIT基因成功转染HL60细胞，并能够进行表达，MTT实验显示转染的FHIT基因能显著抑制白血病细胞HL60的细胞增殖，流式细胞术实验表明FHIT的转染能显著诱导肿瘤细胞的凋亡，提示FHIT基因表达的改变可能在白血病的发生发展中扮演着重要的角色，为白血病基因治疗的相关研究奠定了基础。有研究显示FHIT表达的缺陷可以用于预测非小细胞肺癌患者的复发及预后［8］。有研究显示FHIT基因表达异常可以作为膀胱恶性肿瘤的诊断依据［9］。ChenX［10］等研究显示对FHIT表达的检测可以为临床鼻咽癌的诊断及治疗提供非常有价值的信息。本实验显示：FHIT基因可以抑制FHIT表达缺陷的白血病细胞HL60的增殖并诱导其凋亡，因此FHIT表达的缺失可能与白血病的发生发展相关，为白血病发生机制的研究奠定了基础。在今后的实验中尚需进一步明确FHIT基因抑制细胞生长和促使细胞凋亡的机制，以期为FHIT的基因治疗奠定基础。

作者：周永莉 牛春燕 刘凯歌 高保华 李雷