复方丹瓜方对培养ECV 304增殖及形态影响的研究

摘要：目的：探讨体现痰淤同治法的中药复方丹瓜方对培养人脐静脉内皮细胞(ECV 304)增殖及形态的影响，以揭示丹瓜方在防治糖尿病高血糖致血管内皮细胞损伤中的作用。方法：以标准的M199培养液、高糖(22.22 mmol/L)培养液、不同浓度的丹瓜方培养液、高糖加不同复方丹瓜方培养液培养ECV 304，观察内皮细胞生长情况及显微形态变化。结果：不同浓度丹瓜方对培养ECV 304细胞的增殖、形态都具有明显影响，浓度越高对细胞增殖的抑制作用越明显；不同浓度丹瓜方均具有促进培养的ECV304多形性及“伪足样”结构形成作用，适当丹瓜方浓度(如1/450)作用显著；过高据(22.22mmol/L)，相当于临床重度高血糖的糖尿病病人对培养的ECV 304也具有抑制作用；丹瓜方和过高糖对细胞的抑制作用不形成叠加。结论：丹瓜万对培养的ECV304具有明显的抑制增殖作用，对细胞形态也有明显的影响。

关键词：痰瘀同治；丹瓜方；血管内皮细胞；动脉粥样硬化；糖尿病

中图分类号：R587.1 R289.5　文献标识码：A　文章编号：1672－1349(2007)09－0844－03

痰瘀同治法临床广泛用于糖尿病慢性并发症的治疗。糖尿病病人痰瘀同病者相当常见，是导致糖尿病慢性并发症泛发的基础。及时合理应用痰瘀同治法，能有效地预防和治疗糖尿病的多种慢性并发症，尤其是慢性血管并发症。为此我们对丹瓜方进行系列研究，本研究着重对丹瓜方培养脐静脉内皮细胞增殖及形态的影响进行观察。

1　材料与方法

1．1　内皮细胞：人脐静脉内皮细胞(ECV304)，购于武汉大学典型物保藏中心(美国ATCC产品)。

1．2　丹瓜方组方：丹参、川芎、瓜蒌、薤白等按等比组成，所有中药材均经专业人士鉴定，由福建中医学院附属人民医院制剂室制成1.1药液，加压蒸气灭菌。该制剂电解质经测定均在人血液电解质正常值波动范围。不含重金属。

1．3　实验分组

1．3．1　不同浓度丹瓜方加高糖培养的比较，标准培养组：月标准培养液培养。标准培养液以M199培养基加入10％胎牛血清、双抗、超蒸水，并加NaHCO3调整pH值。全培养液含葡萄糖浓度为5.55 mmol/L。高糖培养组：葡萄糖浓度为22.22 mmol/L，余同标准培养组。1/150中药加高糖组：高糖培养液每150 mL中含1.1丹瓜方液1 mL(相当于原生药1g)。1/300中药加高糖组，高糖培养液每300mL中含1.1丹瓜方液1mL。

1．3．2　不同浓度丹瓜方、单独高糖培养间的比较，标准培养组同前实验；高糖培养组同前实验；1/150中药培养组：标准培养液每150mL中含1.1丹瓜方液1mL，1/300中药培养组：标准培养液每300mL中含1.1丹瓜方液1mL；1/450中药培养组：标准培养液每450 mL中含1.1丹瓜方液1mL。各组培养液pH值均控制在7.2～7.6。

1．4　传代与培养方法：吸掉旧培养液，用PBS洗涤细胞两次。加入胰酶溶液(1 mL/25cm2，2 mL/75cm2)，作用4 min～7/min，于倒置显微镜下观察，当细胞皱缩、变圆、彼此分离或呈大片状分离，即加入适量含血清的培养液终止消化。反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液，并于倒置显微镜下观察确定。用吸管将悬液移入离心管中，以1 000 r/mm转速离心4 min～5min 。去掉上清液，加入相应的新培养液，吹吸混匀成细胞悬液。细胞计数，根据细胞数量按比例接种到新的培养瓶，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。第三代细胞用于本实验，每6 h观察记录1次。

2　结　果

2．1　不同浓度中药加高糖培养的比较ECV304细胞在标准M199培养液中培养时，长势良好，分布均匀，细胞饱满、大小一致，呈椭圆形或梭形。继续培养至第3天，细胞贴满了整个培养面。同期的高糖，细胞分布较杂乱，胞体较瘦小，细胞质色彩变淡，细胞核深黑，有细长细胞出现，有的形似小蝌蚪。放大观察倍数可发现较多的多形细胞。细胞数量与标准培养液接近。第3天时，高糖培养细胞大多有黑色“伪足样”结构，以2支为多见，3支、4支者也常见。1/150中药组和1/300加高糖组两组同期细胞，细胞排列紊乱、稀疏，有的成堆，细胞数量偏少，尤其1/150中药组为重。其他情况与高糖培养相似。

2．2　不同浓度中药、单独高糖之间的比较，标准培养液培养12 h时，与前述标准培养液相似。高糖培养12 h多形细胞出现，胞核更黑，胞体较标准培养液组瘦小。单纯中药1/150组及1/300组，胞体、胞核明显较小，细胞有成堆现象，细胞数量明显少于标准组与单纯高糖组。中药1/450，组情况介于标准培养组、高糖培养组及1/300中药组之间，细胞数量不少。培养第3天，标准培养液细胞成梭形，少量三角形细胞，胞体饱满，色彩均匀，细胞排列整齐。高糖培养组，细胞排列较紊乱，胞核更黑，有大量多形核细胞和“伪足样”结构细胞，形态极不规则，细胞数量稍少于标准培养液组。1/150中药组如图10，细胞数量稀疏，胞体明显较小，胞核小且着色较浅，有的细胞核已不明显，细胞周围形成小的双层较明亮的环，细胞轮廓多不太清楚，有少量伸出“伪足样”结构的细胞。1/300中药组，细胞有大约1/3类似1/150中药主体细胞形态，但伸出“伪足样”结构的细胞明显更多，细胞轮廓清楚。1/450中药组，细胞以有“伪足样”结构的细胞为主体形态，多形性明显，数量及比例均多于高糖培养组，胞核及“伪足样”结构呈深黑色。第4天、第5天1/150、1/300中药组细胞约近半数死亡，高糖培养组与1/450中药组细胞成活情况相似。所有中药组细胞均较高糖培养组细胞更为瘦小。

3　讨　论

痰瘀是中医基本理论体系中最具特色的病理概念之一。它既是疾病的产物，也是进一步导致疾病发展变化的内在原因，同时又是一种病理存在形式。因此，充分研究和认识痰与瘀的内涵，对于丰富和发展中医理论，提高中医药防病治病的疗效及科学性，都是很有意义的。糖尿病作为颇具特色的气血津液疾病，在其病理过程中生痰生瘀几乎是疾病进展的常态。随着痰与瘀作为病理产物逐渐产主，同时也作为致病因素导致或加重了糖尿病慢性并发症的发生或发展。痰与瘀在糖尿病进程中的这种特殊角色，决定了其具有进展性、普遍性和病程相关性(病程越长越常见)特点。因此痰瘀同治法在糖尿病慢性并发症的防治中具有关键作用，且确可能形成突破。我们在长期临床工作中用痰瘀同治法治疗糖尿病血管神经慢性并发症，取得了可靠的疗效。

已有体外研究发现，高浓度的葡萄糖培养血管内皮细胞可破坏细胞形态，抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡。刘小鹏等研究发现，经高糖(11 mmol/L)处理的人脐静脉内皮细胞中血管内皮生长因子mRNA的转录水平明显高于正常血糖(5.5 mmol/L)对照组(P＜0.05或P＜0.01)，但脐静脉内皮细胞经22 mmol/L。葡萄糖作用72 h后，血管内皮生长因子mRNA水平不再升高，而呈下降趋势(P＜0.05)，血管内皮生长因子蛋白表达也逐渐下降。血管内皮生长因子的生物学作用主要为促进内皮细胞增殖，提高血管的通透性，增加微血管特别是毛细血管后静脉和小静脉的渗透性及改变细胞外基质。在某些生理或病理情况下都与血管形成和增生密切相关。可见适当高糖促进内皮细胞增殖，而过高葡萄糖浓度(简称“过高糖”，即≥22.22mmol/L)则抑制细胞增殖。本研究22.22 mmol/L的葡萄糖总体上显示出对细胞抑制效应，与上述研究基本符合，但发现过高糖促成了“伪足样”结构的形成，这使得培养细胞形成多形性的特征。不同浓度丹瓜方均对培养细胞具有抑制作用，表现为胞体的瘦小及不同程度数量的减少。丹瓜方似乎具有较过高糖更为湿著的细胞增殖抑制作用。1/150丹瓜方组由于细胞成活相对较少，这种促进作用不甚显著，但在1/300，1/450的丹瓜方培养液中，随着中药浓度的降低，细胞成活增多，“伪足样”结构细胞也显得较多。但在中药联合高糖培养情况下，未发现这种促进作用的叠加。

通过本实验可初步得出下列认识，不同浓度月瓜方对培养ECV 304细胞的形态、增殖都具有明显影响，浓度越高对细胞的抑制作用越显著，不同浓度丹瓜方均具有促进培养的ECV304细胞多形性及“伪足样”结构形成作用，适当月瓜方浓度(如1/450)这种作用极为显著；过高糖(22.22 nmLol/L，相当于临床重度高血糖的糖尿病病人)对培养的ECV304也具有抑制作用；丹瓜方和过高糖对细胞的抑制作用不形成叠加。进一步的实验发现具有“伪足样”结构的细胞列秋水仙碱细胞毒的耐受性显著增加。