益气养阴、活血化瘀方对病毒性心肌病小鼠心肌MMP-1 mRNA表达的影响

摘要：目的：观察益气养阴、活血化瘀方对病毒性心肌病小鼠心肌基质全属蛋白酶1(matrix metalloprotemase－1，MMP－1)mRNA表达的影响。方法采用反复腹腔注射柯萨奇B3m病毒的方式复制动物模型，270只Balb/c小鼠随机分为5组，空白组30只，模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、西药组各60只；HE和VG染色观察小鼠心肌形态学变化；RT-PCR法检测心肌组织MMP－1 mRNA的表达水平。结果：益气养阴、活血化瘀万能明显改善病毒性心肌病小鼠心肌病理形态及超微结构的变化，下调心肌组织MMP－1 mRNA的表达水平，以中药高剂量组效果最显著，MMP－1为0.35±0.11。结论：益气养阴、活血化瘀方能通过下调MMP－1 mRNA的表达，抑制细胞外基质降解及心肌重构，这可能是其防治病毒性心肌病的作用机制之一。

关键词：益气养阴、活血化瘀方；病毒性心肌病；基质金属蛋白酶

中图分类号：R542.2 R285.6　文献标识码：A　文章编号：1672－1349(2007)09－0839－03

近年来的研究认为，病毒感染及其介导的免疫损伤参与了病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)与扩张型心肌病(ddatedcardromyopathy，DCM)的发生与发展，并可能是VMC演变为DCM的一个重要原因，可将二者统称为病毒性心肌病(vualmyocardml dsease，VMD)。本研究通过建立柯萨奇病毒重复感染致病毒性心肌病的动物模型，观察益气养阴、活血化瘀方对小鼠心肌组织形态学及基质金属蛋白酶－1(MMP－1)mRNA表达水平的影响，初步探讨其作用机制，为寻求中医药治疗VMD提供理论依据。

1　材料与方法

1．1　实验动物、病毒及药物：雄性Balb/c小鼠270只，(3～4)周龄，由北京军事医学科学院实验动物中心提供。柯萨奇B3m病毒(CVB3m)由哈尔滨医科大学克山病研究所提供，在Hela细胞中测50％组织感染率(TCID50)为10。益气养阴、活血化瘀方由黄芪、红参、生地黄、麦冬、五味子、川芎、丹参、等药物组成。中药经水提取，制成浸膏，含水量为21％。用蒸馏水稀释，调整浓度为82％，即相当于每毫升悬液中含生药4.3 g备用，由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室提供。马来酸依那普利由扬子江药业集团江苏制药股份有限公司生产(批号：05080301)。

1．2　主要试剂与仪器RNA，cDNA，PCR试剂盒均为(美国Promega公司生产)，NMP－1和β－actin引物(上海捷倍思基因有限公司)，透射电子显微镜(美国FEI TECAIG公司)，普通光学显微镜(日本Olympas公司)，轮转式组织切片机(德国莱卡公司)，DYY－8B电泳仪(北京医疗设备厂)，EPPERFOR2002型梯度PCR仪(德国LEICA VLTRACUT公司)等。

1．3　实验分组与模型制备：240只Balb/c小鼠随机分为4组：模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、西药组，每组各60只。另取30只小鼠作为空白组。模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、西药组均于实验1d，8d，15d，22d，36d，50d时给予腹腔注射RM1640液稀释的0.1 mL10-4 TCID50 CVB3m，0.1 mL10-3TCID50 CVB3m，0.2mL10-3 TCID50 CVB3m，0.1 mL10-3TCID50 CVB3m，0.1 mL10-3TCID50 CVB3m，0.1 mL10-3TCID50 CVB3m空白组给予同体积的RM1640液。

1．4　给药及取材方法：各组均于末次病毒注射后10 d，即实验的第60天开始灌胃。中药低、高剂量组分别给予益气养阴、活血化瘀方混悬液灌胃，中药低剂量组10.35 g/(kg・d)；中药高剂量组20.70 g/(kg・d)，以上给药剂量均为生药量。西药组按1.3 mg/(kg・d)灌服用蒸馏水稀释的浓度为0.65％的马来酸依那普利混悬液。模型组和空白组灌以同体积蒸馏水。每日1次灌胃，连续4周。实验结束时，无菌取出小鼠心脏，4℃预冷生理盐水冲洗血污，滤纸吸干，电子天平称取心脏重量。沿左室长轴将心脏一分为二，一半置70℃冷冻保存，另一半再一分为二，1/2置4％多聚甲醛中固定，1/2置3％戊二醛中固定。1 5病理学检测HE染色观察心肌的病理学改变，VG染色观察心肌间质胶原纤维变化。

1．6　心肌组织总RNA的提取：每例心脏组织标本各取100mg，采用Tnzol一步法提取心肌总RNA，在紫外分光光度仪下洲定A260与A280值，计算RNA浓度。

1．7　RT－PCR取RNA 5μg进行反转录。再以反转录反应液1μg作为模板，加入相应引物进行PCR扩增。

1．8　统计学处理：应用SPSS13.0统计软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组均数间的比较应用方差分析，两两比较应用q检验。

2　结　果

2．1　小鼠心脏质量指数变化：与空白组相比，模型组及中药低剂量组小鼠心脏/体重比值均明显增高(P＜0.05)，而中药高剂量组、西药组与空白组相比也有增高，但无统计学意义(P＞0.05)；与模型组相比，中药低剂量组、中药高剂量组、西药组小鼠心脏/体重比值均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，其中尤以中药高剂量组和西药组明显(P＜0.01)。

2．2　心肌组织HE染色结果：空白组小鼠心肌纤维排列整齐，间质血管无改变，未见心肌细胞变性、坏死；模型组小鼠心肌纤维排列紊乱、断裂，心肌细胞肥大，空泡变性，血管充血出血，少量炎细胞浸润，间质纤维化明显，中药低剂量组小鼠心肌纤维排列较紊乱，心肌细胞空泡变性，血管充血出血，少量炎细胞浸润，间质轻度纤维化；中药高剂量组小鼠心肌纤维排列紊乱较轻微；未见心肌断裂，血管充血出血，少量炎细胞浸润，间质纤维化程度轻微，西药组小鼠心肌纤维排列轻微紊乱，未见心肌断裂，血管充血出血，少量炎细胞浸润，间质纤维化程度轻微。

2．3　心肌组织VG染色结果：空白组小鼠心肌内偶见被染成红色的极纤细的胶原纤维；模型组小鼠心肌明显可见大量的胶原纤维围绕在坏死心肌周围；中药低剂量组小鼠心肌可见较大量的胶原纤维，范围较广；中药高剂量组小鼠心肌可见血管间质有少量胶原纤维聚集；西药组小鼠心肌可见血管间质有较少量

胶原纤维聚集。以上结果提示病毒感染小鼠心肌病灶的局部胶原结缔组织增生，间质纤维化。用图像分析系统对各组胶原容积分别进行计算。

2．4　小鼠心肌组织MMP－1 mRNA表达检测结果

2．4．1　小鼠心肌组织MMP－1mRNA电泳条带比较各组β－actm电泳条带亮度一致，扩增片段均为450bp。MMP－1mRNA在琼脂糖电泳凝胶上紫外灯下观察均可见387 bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异。

2．4．2　小鼠心肌组织MMP－1 mRNA电泳产物灰度扫描值变化与空白组相比，各组小鼠心肌组织MMP-1 mRNA表达升高(P＜0.05)；与模型组相比，中药低剂量组心肌组织MMP－1mRNA表达降低(P＜0.05)，而中药高剂量组、西药组心肌组织MMP-1 mRNA表达明显降低(P＜0.01)；中药高剂量组、西药组与中药低剂量组相比，心肌组织MMP－1 mRNA表达降低(P

3　讨　论

目前病毒性心肌病动物模型制作主要包括如下几种类型．一类是自发性心肌病模型，另一类是应用物理、化学及药物诱发的心肌病模型，再一类是利用分子生物学的方法(如转基因)诱导心肌病模型。物理诱导的方法如李佳等采用心房快速起搏致扩张型心肌病犬模型，白融等采用快速心室起搏制备扩张型心肌病心力衰竭犬模型等。化学诱导的方法如袁王景等采用腺苷酸转位酶诱导自身免疫性的心肌病小鼠。药物诱导的方法多用呋喃唑酮、阿霉素等。此外，就是反复病毒注射诱导的病毒性心肌病模型。文献报道致病毒性慢性心肌损伤动物模型大多采用柯萨奇B病毒小剂量多次腹腔注射的方式，从而形成病毒持续感染的状态，模拟类似于人类的病毒性心肌病的病变情况。

心脏组织中的细胞外基质(ECM)的合成和降解处于严格的调控之下，当这种平衡被破坏，心脏的结构、形态和功能就会受影响。正常心脏胶原合成是一个动态的过程，合成增加和(或)降解减弱均导致胶原累积，但心室重塑的意义不仅在于胶原的量变，更重要的是心肌基质胶原网破坏、消失。心室重塑是VMD的重要病理过程。基质金属蛋白酶(MMP)是基质胶原代谢的重要蛋白酶，其活性及平衡受到破坏，必然导致基质胶原代谢紊乱，ECM积聚，心肌细胞滑移，最终导致心室重塑。本研究发现与空白组相比模型组大鼠心肌MMP－1mRNA表达明显升高(P＜0.01)，心脏/体重比值增高(P＜0.05或P＜0.01)，心肌胶原容积分数明显增高(P＜0.01)，心肌纤维排列紊乱、断裂，间质纤维化明显，说明在VMD的病理过程中，MMP－1水平上调，MMP－1的相对量和(或)活性增加，促使胶原纤维增生，心室重量增加，从而导致心肌重塑。与模型组相比，中药低剂量组、中药高剂量组小鼠心脏/体重比值均降低(P＜0.05)；心肌胶原容积分数明显降低(P＜0.01)；中药低剂量组心肌组织MMP－1 mRNA表达降低(P＜0.05)或P＜0.01)；且中药低剂量组、中药高剂量组较模型组心肌病理改变轻微。可见益气养阴、活血化瘀方可能是通过下调MMP－1表达水平，从而抑制心肌胶原纤维增生及心肌间质纤维化，改善VMD病理形态的变化而起到保护心肌的作用，这可能是其防治VMD的作用机制之一。