CHK1 shRNA—617与卵巢癌Skov3细胞放疗敏感性的研究

【摘要】 目的：本研究以shRNA干扰CHK1在卵巢癌Skov3细胞中的表达，观察其2Gy照射后细胞凋亡情况。方法：采用shRNA技术沉默Skov3细胞中CHK1的表达，用流式细胞仪观察细胞凋亡率。结果：X射线照射后4hr和28hr，转染CHK1 shRNA的Skov3细胞的凋亡百分数为21.53%±2.51%、15.30%±2.57%，显著高于单纯转染CHK1shRNA-617组（P

【关键词】 CHK1； 卵巢癌

细胞周期检测点是保证细胞的遗传物质正确复制并被精确传到下一代的调控机制。检查点激酶1（checkpoint kinase 1 ，CHK1）是细胞周期重要检测点激酶[1]。目前研究提示CHK1的高表达与肿瘤的耐药、不良预后有关。本课题将针对CHK1基因617位点的shRNA表达载体导入Skov3细胞，观察辐射后对Skov3细胞凋亡的影响。

1材料与方法

1.1主要试剂及仪器

人卵巢癌细胞株Skov3细胞购自大连宝生物工程有限公司；pGPU6/GFP/Neo购自上海吉玛制药技术有限公司；BbsⅠ、BamHⅠ、PstⅠ、T4 DNA ligase购自TaKaRa；LipofectamineTM2000购自Invitrogen ；CHK1的引物购自大连宝生物工程有限公司；CO2培养箱选用日本三洋公司1WCD-175 Sanyo；恒温水浴箱选用北京长安科学仪器厂SBHW2-1；深部X射线治疗机选用飞利浦公司；FACScan流式细胞仪选用美国BD公司。

1.2细胞培养

用含10%小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养，置于37℃、5%CO2培养箱中培养卵巢癌Skov3细胞。

1.3载体构建和筛选

根据人CHK1基因在GenBank登录号选择CDS区，应用shRNA设计软件，选择CHK1干扰RNA的靶点，设计shRNA。同时选取无关序列GTTCTCCGAACGTGTCACGT构建对照载体shNC。取pGPU6/GFP/Neo载体2μg，通过BbsⅠ和BamHⅠ酶切后测序鉴定并用脂质体介导转染shRNA载体。应用RT-PCR和免疫组化筛选出有效的shRNA表达载体CHK1 shRNA-617。

1.4照射条件及流式检测

转染shRNA后20h，用PBS洗细胞，加2mlPBS后采用飞利浦X线治疗机对Skov3细胞进行照射。照射电压为200kV，电流为10mA，总照射量为2 Gy，剂量率0.287Gy/min。照射后更换新鲜的培养基，继续培养4h或28h（转染后24h或48h）收集细胞，PBS洗3次，每次离心800rpm，5min；AnnexinV/PI染色10min，PBS洗3次。应用BD 公司流式细胞仪检测、分析细胞凋亡。

1.5分组

选不予任何处理的Skov3细胞作为Control组；转染shNC的Skov3细胞不予任何处理作为shNC组；Skov3细胞经X线照射的作为radiation组；CHK1shRNA-617转染Skov3细胞作为CHK1shRNA-617组；将转染shNC的Skov3细胞给予X线照射作为shNC+radiation组；将CHK1shRNA-617转染Skov3细胞经X线照射的作为CHK1shRNA-617+radiation组。

1.6统计学方法

应用SPSS14软件进行统计分析，平均值±标准差（± s）的比较采用t检验，以P

2结果

X射线照射后4hr，转染CHK1 shRNA-617的Skov3细胞的凋亡百分数为21.53%±2.51%，显著高于单纯转染CHK1shRNA-617组（t=4.3965，P=0.0013

3讨论

人类CHK1基因位于染色体11q24，编码476个氨基酸组成的蛋白质，是丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶，在DNA损伤引起的细胞周期检测点调节中起着非常重要的作用。CHK1由SQ/TQ区、N端激酶区域、一个可变连接区和C端抑制性区域构成。SQ/TQ区有保守的丝氨酸-谷氨酰胺或是苏氨酸-谷氨酰胺序列，当DNA损伤后，该位置被共济失调性毛细血管扩张症突变基因（ataxia telangiectasia mutatedgene ，ATM）和运动失调性毛细血管扩张症突变基因ATM相关基因（Ataxia-telangiectasia and Rad-3 related ，ATR）磷酸化从而激活CHK1。研究发现N端激酶区域有与促凋亡因子同源的氨基酸残基序列，可通过自身磷酸化修饰来达到促进凋亡的作用。C端抑制性区域目前体外研究发现可以抑制CHK1活性。

当DNA遭受紫外线、电离辐射、病毒、化学物等因素影响后导致DNA损伤，从而激活CHK1，致使细胞阻滞在S期、G2/M期检测点[2]，使受损的DNA得以及时修复，从而维持基因组的完整性。CHK1是S期检查点所必需的，当DNA合成受抑制时，被磷酸化激活的CHK1可以使阻断的复制晚期起始点重新激活，并确保已阻滞的复制叉完整。同时，CHK1在G2期阻滞中扮演关键角色，对G2期检测点的调节主要通过ATR-CHK1-CDC25C[3]路径实现的。当DNA复制阻滞，解旋酶还在继续解链，这样就形成单链DNA-复制蛋白A复合体。该复合体可通过ATR的相互作用蛋白来募集ATR，同时募集和激活下游复合物将其结合到拖延复制叉处。拓扑异构酶Ⅱ结合蛋白1结合Rad9-1-1激活ATR，活化的ATR再使Rad17和Rad9-1-1磷酸化，将信号进一步传递到下游。

CHK1在肿瘤细胞DNA损伤应答系统中起着核心主导调节作用，不但可调节肿瘤细胞的周期检测点[4]，还可以参与肿瘤细胞DNA修复、转录和凋亡等[5]。因此，CHK1成为消除G2期阻滞的靶分子。我们研究发现X射线照射后4hr和28hr，转染CHK1 shRNA的Skov3细胞的凋亡百分数显著高于单纯转染CHK1shRNA-617组（P

参考文献

[1]Merry C， Fu K， Wang J，et al. Targeting the checkpointkinase CHK1 in cancer therapy. Cell Cycle，2010， 9（2）： 279-283.

[2]Pan Y， Ren KH， He HW，et al. Knockdown of Chk1 sensitizes human colon carcinomaHCT116 cells in a p53-dependentmanner to lidamycin through abrogation of a G2/M checkpointand induction apoptosis.Cancer Biol Ther， 2009， 8（16）： 1559-1566.

[3]Ling H， Wen L， Ji XX，et al. Growth inhibitory effect and CHK1 dependent signaling involved in G2 /M arrest on human gastric cancer cells induced by diallyl disulfide. Braz J Med BiolRes，2010， 43（3）： 271-278.

[4]Matsumoto K， Nagahara T， Okano J， et al. The growth inhibition of hepatocellular and cholangiocellular carcinoma cells by gemcitabine and the roles of extracellular signal-regulated and checkpoint kinases. Oncol Rep， 2008， 20 （4）：863-872.

[5]LOFFLER H， BOCHTLER T， FRITZ B， et al. DNA damage-induced accumulation of centrosomal Chk1 contributes to its checkpoint function . Cell Cycle， 2007， 6（20）：2541-2548.