生物钟基因Per2在结直肠癌诊断中的应用价值探讨

【摘 要】目的：具体探讨生物钟基因Per2在结直肠癌诊断中的应用价值。方法：选择2009年4月至2013年1月间32例于我院行结直肠癌根治术患者的手术切除标本作为样本，同期选择32例正常肠道组织作为对照样本，采用免疫组织化学方法检测生物钟基因Per2蛋白的表达。结果：切片镜下显示肿瘤中较配对的正常肠道组织中Per2蛋白的表达呈明显增高，在细胞核及细胞浆中均见强阳性。随Dukes分期的增强，Per2表达阳性表达率及阳性强度呈递增趋势，Per2中度及强阳性表达与Dukes分期呈正相关（P

【关键词】生物钟基因；结直肠癌；Per2蛋白；免疫组织化学方法；Dukes分期

【中图分类号】R735 【文献标识码】A 【文章编号】1004―7484（2013）11―0148―01

众所周知，人类、老鼠和其它许多植物、动物都拥有一个内在的生物钟，使得生理、行为和生化的周期节奏与一天24小时的昼夜循环相一致。当前研究显示，生物的昼夜节律失调是肿瘤发生和进展的内在因素之一。恶性肿瘤的研究目前发展到从分子水平和蛋白水平寻找防治新手段【1-2】。众多数据显示，生物钟基因per2基因的过表达可以促进肿瘤细胞的凋亡，促使实验动物体内的肿瘤缩小，其过表达还可以对细胞的放射性损伤起到修复作用，这一发现对肿瘤的临床治疗具有重要的指导意义【3-4-5】。本文为此具体综述与临床分析了生物钟基因Per2在肿瘤学的研究概述与应用价值，现分析如下：

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2009年4月至2012年1月间32例于我院行结直肠癌根治术患者的手术切除标本作为样本。入选标准：所有病例术前均未行相关手术治疗或放化疗。所有病例经术后病理证实为结直肠腺癌；患者同意留取标本进行研究。其中男性17例，女性15例；年龄分布于40-79岁，平均61.25±3.21岁，中位年龄61岁；病理组成：隆起型腺癌II级16例，溃疡型腺癌II级10例，浸润型腺癌II级6例； Dukes分期：A期10例，B期12例，C期10例。同期选择32例正常肠道组织作为对照。

1.2 标本采集

在手术切除标本自大体切断所有血供后15分钟内，自肿瘤侵犯处肠壁取材作为实验组，自远离肿瘤近标本切缘处肠壁取材作为对照组，所取标本立即投入液氮中暂存，后放入-70℃冰箱保存，用作组织RNA的抽提。全部标本经10%中尔马林固定，石蜡切片用作免疫组织化学检验。

1.3 免疫组织化学方法检测

免疫组织化学检测采用Envision两步法，DAB显色；石蜡切片经二甲苯脱蜡三次，经100%、95%、80%的酒精蒸馏水水化，蒸馏水充分洗净；0.3%H202甲醇液室温20分钟，TBS（0.05M，PH7.6，下同）洗5分钟×3次；枸橼酸缓冲液（O.01M，PH6.O）高温预热5分钟，将脱腊水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中火加热5分钟×2次，低火保温5分钟后取出微波盒，冷却至室温取出玻片，先用蒸馏水洗两次后用TBS洗5分钟X3次。5%小牛血清蛋白3TC孵育20分钟。滴加一抗（兔抗人Per2 1：50），37℃温箱1小时，TBS洗5分钟X3次。选择Envision抗兔工作液，37℃温箱1小时，TBS洗5分钟X3次。10mlTBS液中加入4mgDAB，充分混匀，滴加0.5mlH202，室温下显色5-lO分钟，显微镜下控制着色浓度。常规苏木素复染细胞核1分钟，脱水，透明，封片。显微镜观察。

1.4 阳性结果评分标准

显微镜下观察，在清晰的背景上细胞质呈现棕色为阳性，同时采用分数判断法，0分为阴性（-），1-4分为弱阳性（+），5-8分为中度阳性（++），9-12分为强阳性（+++）【6】。

1.5 统计学处理

应用SPSS18.0统计软件进行分析。P

2 结果

2.1 图像分析

Per2表达情况免疫组织化学结果显示，32例人结直肠癌组织与相配对的正常肠道组织相比较，Per2蛋白表达量明显不同，全部切片均显示肿瘤中较配对的正常肠道组织中Per2蛋白的表达呈明显增高，在细胞核及细胞浆中均见强阳性。具体见图1与图2。

2.2 分数判断分析

经过具体判断，在正常组织中Per2蛋白均呈阴性表达或者弱性表达；而结直肠癌组织中，中度及强阳性表达率高达93.8%（30/32），两组对比差异明显（P

3 讨论

生物钟“振荡器”（相当于钟表的擒纵器）就是位于细胞核内的“生物钟基因”，更准确地说，就是该基因的转录与蛋白质合成过程中的负反馈机制。这个结论来自对突变体的研究，某些生物体内的基因突变会导致生物钟变长、变短或者紊乱，而且这种改变可以随着这个基因遗传给下一代，这一点进一步证明了生物钟的确和基因有关。外周生物钟位于组织细胞内，具有与母钟基本相似的基因种类和振荡模式，哺乳动物的生物钟基因最早是在下丘脑视交叉上核中被发现的。至目前为止，哺乳动物至少有十种调节昼夜节律的基因，其中Per基因是调节生物节律的主要基因。Per基因首先在果蝇中被发现，小鼠和人的Per基因约16kb，含23个外显子序列，它们的结构具有很强的同源性，并且存在Per1、Per2、Per3亚型。相关的基础性研究发现一种人类Per2基因的突变可以引起FASPS症状。这是S662G突变，即662位点处丝氨酸被甘氨酸取代，从而阻止了该位点的磷酸化修饰。同时，研究者发现在正常小鼠中插入人类的突变基因会让这些小鼠也起早，印证了人类的FASPS症状。形成对比的是，如果在662位点处发生的突变可以引起磷酸化能力增强的话，PER2的转录水平会上升，小鼠睡眠的时间也会推迟【8】。而之后的一项动物实验却发现长期暴露于光线可以使小鼠发生乳腺肿瘤的危险性降低【9】。32例人结直肠癌组织与相配对的正常肠道组织相比较，Per2蛋白表达量明显不同，全部切片均显示肿瘤中较配对的正常肠道组织中Per2蛋白的表达呈明显增高，在细胞核及细胞浆中均见强阳性。在正常组织中Per2蛋白均呈阴性表达或者弱性表达；而结直肠癌组织中，中度及强阳性表达率高达93.8%（30/32），两组对比差异明显（P