陕西省茯砖茶“金花”菌的鉴定分析

摘要：采用稀释平板法，利用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行培养，首次对茯砖茶发源地陕西省生产的茯砖茶中的“金花”菌进行了鉴定研究。通过分离纯化，获得了菌株JW0；通过菌落特征和形态学观察及回接陕南晒青毛茶，确认该菌株为子囊菌纲、曲霉目、曲霉科、散囊菌属、冠突散囊菌；其无性型为小冠曲霉，异名冠突曲霉、针刺曲霉。

关键词：茯砖茶；冠突散囊菌；分离；回接；陕西省

中图分类号：TS272.5+4；Q949.327.1；Q93-331（241） 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）02-0345-04

中国茯砖茶生产历史悠久，因其具有神秘“金花”（金黄色的菌体）而备受关注。“金花”是茯砖茶在特定温度、湿度条件下，通过“发花”工艺长成的自然益生菌体，民间俗称“金花”。该茶最初是由湖南省所产的黑毛茶运往陕西省泾阳市筑制茯砖而成，早期称“湖茶”；因在夏季伏天加工，故又称“伏茶”。该茶于20世纪50年代转产于湖南省，80年代湖北省也开始生产；目前有关“金花”菌的分离、鉴定、生理特性、功能特性以及与茯砖茶品质形成的关系等[1-3]方面的研究，多以湖南、湖北等省生产的茯砖茶为研究对象，而关于茯砖茶发源地陕西省茯砖茶中的“金花”菌研究鲜有报道。试验采用稀释平板法从来自陕西省生产的茯砖茶中分离出“金花”菌――冠突散囊菌 [Eurotium cristatum（Raper & Fennell）Malloch & Cain]，并对其进行了回接试验和形态学鉴定，以期为进一步研究和优化茯砖茶生产技术提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

供试样品为含有“金花”的茯茶砖，毛茶为陕南晒青毛茶，均由陕西省咸阳市泾渭茯茶有限公司提供。供试培养基一类是分离纯化培养基，有马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）；另一类是形态鉴定培养基，包括察氏琼脂培养基（CZ）、20%蔗糖察氏琼脂培养基、40%蔗糖麦芽汁琼脂培养基。

1.2 方法

1.2.1 “金花”菌的分离纯化 参照杨抚林[4]的研究方法，先将茶砖用粉碎机磨碎，过80目筛，筛底用于菌种分离。称取10 g 筛底样品，放入带有玻璃珠的250 mL三角瓶中（内装90 mL去离子水），置恒温摇床上200 r/min振荡30 min，得到的混悬液即为母液。从母液中吸取5 mL 上清液，加入到45 mL去离子水中，依次进行10倍递增稀释，制成10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%稀释液。选取适宜的相连3个梯度，吸取0.1 mL 混悬液加入已备好的PDA平板培养基上，用无菌玻璃棒涂布均匀，每一稀释浓度做3个重复，并以去离子水做空白对照。将平板倒置于28 ℃培养箱中黑暗培养4 d后，用接种环挑取单菌落的黄色闭囊壳在空白PDA平板上划线，经过这样2～3次划线培养就可获得该“金花”菌的纯培养，最后转接于PDA斜面试管中，于28 ℃培养5 d后，4 ℃冰箱保存，备用。

1.2.2 “金花”菌的形态学鉴定 采用平板培养法，将纯化后的菌株接种于直径9 cm、加有CZ培养基和20%蔗糖察氏琼脂培养基及40%蔗糖麦芽汁琼脂培养基的培养皿上，于28 ℃暗室培养，每天观察菌落形态，测量菌落直径。挑取菌丝及黄色闭囊壳在显微镜下观察和照相。菌种鉴定参照文献[5]的方法。

1.2.3 回接毛茶 参照文献[6]的方法将陕南晒青毛茶剪成长度约1 cm的小段，称取30 g放入500 mL三角瓶中，加入去离子水10 mL，振荡混匀放置1 h后，于121 ℃灭菌20 min，冷却后将含有“金花”菌子囊孢子的无菌水均匀洒入已灭菌的陕南晒青毛茶中，接入浓度为1×106～10×106个/mL的孢子混悬液1 mL，对照不接菌。置于28 ℃培养箱中培养，每天观察茶样变化。

2 结果与分析

2.1 “金花”菌的菌落形态及培养性状

经过分离纯化，从含有“金花”菌的茯砖茶中分离获得了一株产黄色闭囊壳的菌株，菌株编号为JW0。该菌株的菌落在CZ培养基上生长缓慢，菌落形态特征如图1-A所示。在28 ℃条件下培养7 d菌落直径可达31 mm，培养14 d达64 mm；菌落周边黄色，中心部分颜色较深，近于橄榄褐色至丁香褐色；具饰菌丝黄色，老化后变成褐色；菌落中央呈现少量灰褐色的渗出物，未见分生孢子结构；色素扩散于基质中，菌落周围和反面呈黑褐色。

菌落在20%蔗糖察氏琼脂培养基上生长较快，28 ℃条件下培养7 d菌落直径可达55 mm、培养12 d长满平皿；中央菌落呈肉桂浅黄色至灰色，边缘黄色，菌落表面呈现簇状菌丝形态，分泌色素减少，培养基颜色比在CZ培养基上的浅，边缘可见分生孢子结构。

菌落在40%蔗糖麦芽汁琼脂培养基上生长很快，28 ℃条件下培养6 d即可长满平皿；菌落黄色，菌落中央和边缘颜色相差不大，菌落边缘有稀疏的分生孢子结构，菌落反面黄色。

2.2 “金花”菌的显微形态特征

显微观察可见JW0菌丝体无色，没有分支，具隔膜；闭囊壳黄色，呈球形或近球形，成熟较快，直径82～180 μm，处于具饰菌丝网中（图1-B）；闭囊壳中含有大量子囊，子囊球形或近球形，大小为10～14 μm，每个子囊含有8个子囊孢子（图1-C）；子囊孢子呈双凸镜形，表面不光滑，孢子体大小为5～6 μm×4～5 μm（图1-D）。分生孢子头呈灰绿色，幼时球形，直径37～75 μm，成熟后呈疏松放射状；分生孢子梗壁光滑，梗茎长125～300 μm、粗5～9 μm（图1-E）；顶囊球形或烧瓶形，直径20～30 μm；产孢结构单层，瓶梗直接生于顶囊上，大小为6.4～9.6 μm×2.4～3.2 μm，瓶梗成熟后分生孢子从瓶梗顶端以出芽方式发育（图1-F，图1-G），分生孢子呈球形或椭圆形，壁粗糙，大小为4.0 ～4.8 μm×3.2～4.0 μm。随着分生孢子的成熟，其下端的另一个分生孢子在瓶梗顶端开始发育，将其向外顶出，从而使分生孢子串生在瓶梗顶端，有些孢子单个脱落，而有些孢子则成串脱落（图1-H），可见明显的孢间联体。

2.3 “金花”菌回接毛茶试验

经接入菌株JW0的陕南晒青毛茶培养5 d后，茶叶表面长出白色菌丝，与瓶壁接触部位出现黄色粉末状物质；培养7 d后，茶叶表面长出大量的黄色颗粒状物质（图2-A，图2-B），与瓶底和瓶壁接触部位的颗粒较大，形态颜色与茯砖茶中的“金花”菌相同（图2-C）。挑取黄色颗粒进行显微观察，其形态特征与已发花的茯砖茶中的“金花”菌相同。

经形态学鉴定和回接试验，参照文献[5]的方法并结合温琼英[7]和彭晓等[8]的研究结果，将菌株JW0鉴定为冠突散囊菌[Eurotium cristatum （Raper & Fennell） Malloch & Cain]，属子囊菌纲（Ascomycetes）、曲霉目（Eurotiales）、曲霉科（Eurotiaceae）、散囊菌属（Eurotium Link Fr.）。其无性型为小冠曲霉（Aspergillus cristatellus Kozak.） ，异名冠突曲霉（A. cristatus Raper & Fennell）、针刺曲霉（A. spiculosus Blaser）。

3 讨论

冠突散囊菌在我国分布普遍，是茯砖茶发酵的优势菌[7]。试验首次对陕西省生产的茯砖茶中的益生菌进行分离鉴定，得到了一株菌株JW0，其菌落形态和光学显微特征与文献[9]、文献[10]描述的特征相同。为进一步验证所分离的菌株是否就是茯砖茶中的“金花”菌，又将分离菌株接种在当地生产的陕南晒青毛茶中，结果表明所分离的菌株的确为冠突散囊菌。

冠突散囊菌在CZ培养基上生长缓慢，在20%蔗糖察氏琼脂培养基上生长较快，而在40%蔗糖麦芽汁琼脂培养基上生长最快，在3种培养基上的生长速度均比文献[9]测定的结果快，表明培养温度为28 ℃时更适宜此菌生长。光学显微镜下观察，冠突散囊菌子囊孢子侧面呈椭圆形，长“赤道”处具有2条明显的纵向突起的脊，凸面粗糙，正面呈同心圆形，边缘参差不齐，不光滑，这与温琼英[7]、黄浩等[11]研究的结果相同。分生孢子呈球形或椭圆形，表面有突起，两端平截，与彭晓等[8]研究的结果相似。该菌在一般条件下进行有性生殖，产生子囊孢子，无论是紧压的砖茶还是疏松的散茶，发酵结束后均可得到黄色的闭囊壳。冠突散囊菌在高温或者高渗透压下利于产生分生孢子，一般在35～37 ℃时形成分生孢子较多，当培养基内蔗糖含量达到80%以上或者NaCl浓度达到14%以上时，产生大量分生孢子[12]。

试验将含有冠突散囊菌子囊孢子的无菌水均匀洒入已灭菌的陕南晒青毛茶中，培养7 d后，可观察到与茯砖茶中形态颜色相同的“金花”，其显微形态特征与原菌株JW0相同，这个结果表明，陕南晒青毛茶中的“金花”菌与茯砖茶中的“金花”菌实属同一种微生物――冠突散囊菌，黄浩等[11]的研究也证实了这一点。综上所述，从陕西省生产的茯砖茶中分离出的菌株的确为冠突散囊菌，其无性型为小冠曲霉（A. cristatellus），异名冠突曲霉（A. cristatus）、针刺曲霉（A. spiculosus）。

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