重组黏质沙雷菌脂肪酶的可溶性表达及其性质研究

摘要：目的提高重组黏质沙雷菌ECUl010脂肪酶(GST-lipase)可溶性表达量，研究其相关理化性质。方法PCR扩增lipase基因，与表达载体pGEX-4T-1连接后转入E.coli BL21(DE3)，优化培养提高可溶性表达量，表达产物用GST亲和层析柱纯化。研究温度、pH等对酶活性的影响，重组酶的底物特异性以及对(±)-MPGM的手性拆分。结果优化后可溶性酶的活性可达8612.3U/L，纯化9.8倍后比活性为3.3U/mg。重组脂肪酶的最适反应温度为30℃，最适pH为9.0。温度低于30℃、pH 6.0～6.8的条件下比较稳定。Ca2+，Fe2+等金属离子和一些非离子表面活性剂能提高酶的活性。硝基苯月桂酸酯(C12)是其最适底物。以(±)-MPGM为底物，4h后转化率达到47.3％，ee值为89.7％。结论优化后可溶性脂肪酶的活性大大提高，研究了重组脂肪酶的相关性质，为地尔硫革的工业化生产奠定了基础。

关键词：黏质沙雷菌ECU1010；脂肪酶；可溶性表达；纯化；性质；手性拆分

中图分类号：Q556

文献标识码：A

文章编号：1672-979X(2010)03-00077-06

脂肪酶(EC 3.1.1.3)又称三酰基甘油酯水解酶(triacylglycerol acylhydrolase)，它可将中长链甘油三酯催化水解成甘油和脂肪酸，也可以催化酯类合成和酯交换反应，并且在非水溶剂体系中具有高度的区域选择性和立体选择性。因此，脂肪酶在食品工业、生物洗涤剂，医疗和亲脂性精细化学品的酶法生产方面发挥着重要作用。

相比其他的细菌脂肪酶，黏质沙雷菌ECU1010(Serratia marcescens ECU1010)脂肪酶因其潜在的医药应用价值而备受关注。黏质沙雷菌脂肪酶可以高效地选择性拆分地尔硫革(Diltiazem)生产中的关键中间体――消旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯(MPGM)，得到(2R，3S)-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯――(-)-MPGM，后者作为起始合成原料可以直接合成手性顺式(+)地尔硫革。近年，日本科学家将黏质沙雷菌Sr41 8000的脂肪酶基因以及与分泌相关的蛋白基因分别连接到载体pUC19上，再导回野生型菌株，使酶产量增加近140倍。之后他们将该脂肪酶固定在膜反应器上用于拆分MPGM，获得了较好的效果。但是目前尚未实现以E.coli为宿主规模生产有生物活性的脂肪酶。一方面是因为蛋白质的降解或错误折叠，另一方面，外源蛋白质不断在细胞质中积累，对宿主细胞产生毒性作用，导致其死亡。因此，如何提高脂肪酶的可溶性表达量引起我们的极大兴趣。本文从黏质沙雷菌ECU1010的脂肪酶基因出发，研究了克隆、融合表达、纯化及重组酶的相关性质，为药用地尔硫革规模化生产打下了坚实的基础。

1　材料与方法

1.1　菌株和材料

E.coli BL2l(DE3)、表达载体pGEX-4T-1(Novagen公司)；S.marcescens ECU1010(本实验室保存)：Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、质粒PMD18-T、限制性内切酶、DNA Marker(宝生物工程有限公司)；IPTG，即异丙基硫代半乳糖苷、氨苄青霉素(Sigma公司)；谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱(北京Wsac联合有限公司)；各种硝基苯酯均由硝基苯酚和脂肪酸合成；其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2　脂肪酶基因的克隆和表达

PCR扩增脂肪酶的基因。正向引物为5-ggcgaattcatgggcatctttagctataagg-3'(下划线是EcoRI酶切位点)，反向引物为5'-atagcggccgcRaggccaacaccacct-3'(下划线是NotI酶切位点)。将PCR产物连接到pMD18-T载体并测序。把经测序验证的重组质粒用EcoRI和NotI双酶切后电泳回收DN段，用T4DNA连接酶连接到同样双酶切的pGEX-4T-1中，构建表达质粒pGEX-4T-1-1ip。

重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，37℃条件下于100 mL LB培养基(1％蛋白胨，酵母膏0.5％，1％氯化钠，pH 7.0)中二级培养至A600=0.8～1.0，加入终浓度分别为0.2mmol/L、5mmol/L的IPTG和Ca2+，并在15℃条件下诱导表达12h，离心收集菌体。

1.3　重组脂肪酶的分离纯化

用谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析的方法进行纯化。将菌体沉淀重悬于20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，洗涤并离心去除上清液，重复2次。然后将沉淀和细胞碎片重悬于10 mL结合缓冲液(50 mmol/LTris-HCl/100 mmol/L NaCl，pH 8.3)中，于400 w超声波破碎15 min，12 000 r/min离心10 min，取上清用于纯化。用上述结合缓冲液平衡层析柱后上样结合，用含有10 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)的结合缓冲液洗脱，收集洗脱液并测定其活性。SDS-PAGE分析洗脱液纯度。

1.4　重组脂肪酶活性测定和蛋白质含量测定

以对硝基苯酚乙酸酯(pNPA)为底物测定脂肪酶活性。取粗酶液100μL加入2.87 mL 100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pit 7.5)中，30℃保温3 min后加入30μL100 mmol/L pNPA(二甲基亚砜溶液)。于30℃，405 nm波长下测定酶活性。每分钟生成1μmoL对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活单位。脂肪酶对各种对硝基苯酚酯水解活性测定方法同上。但对对硝基苯酚月桂酸酯，肉豆蔻酸酯和棕榈酸酯，则是取粗酶液100μL加入到2.57 mL 100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中，在30℃保温3 min后加入300μL 10mmol/L对硝基苯酚月桂酸酯，肉豆蔻酸酯和棕榈酸酯(二甲基亚砜溶液)，于30℃，405 nm波长下测定酶活性。所有测定重复3次取平均值。蛋白质浓度测定依据Bradford法。

1.5　重组脂肪酶性质

1.5.1　重组脂肪酶的最适温度及温度稳定性　以pMIA为底物，测定25～65℃不同温度下的酶活性，确定脂肪酶的最适温度；将脂肪酶在50 mmol/L Tris-HCI缓冲液中于30，40，50℃保温0.5～2h，然后在30℃下测其残余活性以确定其温度稳定性。

1.5.2　重组脂肪酶的最适pH及pH稳定性　以pNPA为底物，30℃下在pH 5.0～10.0的不同缓冲液中测定酶活。将纯化的脂肪酶置于不同pH的缓冲液于4℃保温

20h，然后30℃测定脂肪酶的残余活性，由此测定脂肪酶的pH稳定性。

1.5.3　金属离子和表面活性剂对重组脂肪酶活性的影响　将纯化的脂肪酶与各种金属离子和表面活性剂置于50mmol/L Tris-HC1缓冲液中，终浓度分别为2 mmol/L和0.1％(w/v)，30℃下保温30min，测其残余酶活，由此测定金属离子和表面活性剂对脂肪酶活性的影响。

1.6　重组脂肪酶的对映选择性水解

将5mL磷酸盐缓冲液(100 mmol/L，pH 7.5)与5 mL(±)-MPGM的甲苯溶液(100 mmol/L)混合形成甲苯-水两相反应系统，加入10 U纯化后的脂肪酶于30℃和160 r/min反应，定时取样测定反应转化率(c)以及剩余底物的对映体过量值(ee)。取样分析时，将50μL反应液有机相加入450μL含内标对硝基苯乙酮(0.5 mmol/L)的乙酸乙酯中，加无水硫酸钠干燥，然后进行手性高效液相色谱(HPLC)分析。转化率、对映选择率(E)及ee的计算依据文献的方法。

2　结果与讨论

2.1　克隆和基因分析

以S.marcescens ECUl010的DNA为模板，通过PCR获得1845 bD的扩增产物。基因分析显示全长脂酶基因编码了614个氨基酸残基，它的活性位点含有1个由Ser-His-Asp/Glu组成的催化3联体，但区别于大多数丝氨酸蛋白酶的是该位点包埋于蛋白质结构的内部。有一个螺旋状短肽遮盖了其活性部位，称之为“盖子”。当与疏水界面相互作用时，通过运动“盖子”会打开使底物分子能自由进入活性部位。

2.2　重组脂肪酶的可溶性表达

为了获得理想的表达结果，我们优化了IPTG浓度、诱导时间和诱导温度等条件。发现低温条件下更容易获得重组脂肪酶的上清表达，结果见图1。

相比于37℃诱导重组脂肪酶，可溶性组分在15℃时大大提高，大约占细胞总蛋白质的26％。优化结果表明，在15℃条件下加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导12 h将获得2 565 U/L的酶活。此外，我们发现诱导时添加终浓度为5 mmol/L的Ca2+能将酶活提高3倍多，达到8 612.3 U/L，高于之前文献的报道，同时也说明该脂肪酶的活性部位存在Ca2+结合位点。

2.3　重组脂肪酶的纯化

据文献报道，通过超滤，硫酸铵沉淀，DEAE离子交换层析3个步骤可以将S.marcescens ECU1010脂肪酶纯化5.5倍，回收率15.8％。而本研究中构建了N端连有GST标签的融合蛋白，以便用亲和层析的方法对脂肪酶进行纯化，结果获得了9.8倍纯化倍数和31.3％的回收率，结果见表1。纯化的重组脂肪酶进行SDS-PAGE电泳，得到一条电泳带，其相对分子质量约为91×103左右，见图2。结果表明，用亲和层析柱纯化该重组蛋白是一种简单、有效的方法。

2.4　重组脂肪酶最适温度和温度稳定性

在pH 8.0的缓冲液中，重组脂肪酶30℃时显示了最大活性。在26～32℃的温度范围内，脂肪酶保留了超过80％的活性，见图3A：30℃保温0.5～2h，脂肪酶保留了80％以上的活性，但是当温度达到50℃时脂肪酶的稳定性急剧下降，仅仅0.5 h后酶活性约降为零，结果见图3B。以上结果表明，低于30℃时，重组脂肪酶是相当稳定的。

2.5　重组脂肪酶最适pH和pH稳定性

在pH 9.0的缓冲液中，重组脂肪酶显示了最大活性。但当pH低于7.0时，脂肪酶几乎失活，见图4A；当pH 5.6～6.8之间，4℃保温20 h后，重组脂肪酶仍然保留了80％以上的活性，见图4B。

2.6　金属离子和表面活性剂对重组脂肪酶的影响

金属离子，尤其是Ca2+对酶的结构和功能产生重要影响，许多Ca2+激活性的脂肪酶已有所报道。金属离子及表面活性剂对脂肪酶活性的影响结果见表2。2mmol/L Ca2+，Fe2+，Mn2+等离子对酶活性有激活作用，尤以Ca2+最强，能使脂肪酶的活性增加100％；而EDTA、Zn2+则表现为不同程度的抑制作用，尤其是2mmol/LEDTA~重组脂肪酶活性丧失严重。

0.1％(w/v)非离子表面活性剂PEG能将脂肪酶的活性提高6％～11％，而0.1％(w/v)Triton X-100和Tween20分别使酶活降低了87％和67％，阴离子表面活性剂SDS则抑制酶活达到90％。由此，可加入金属离子或者表面活性剂来提高反应效率，以优化反应系统。

2.7　重组脂肪酶的底物特异性

以各种对硝基苯基酯为底物对脂肪酶底物特异性进行研究。结果表明，中长链(Nr＞10)的对硝基苯基酯是该脂肪酶的最适底物，其中以对硝基苯月桂酸酯为最佳，见图5。而文献报道，S.marcescens Sr41 8000的脂肪酶更倾向于短链三酰基甘油酯(C4～C4)，S.marcescens ES-2的脂肪酶对中等链长三酰基甘油酯(C8～C12)活性最高。

2.8　重组脂肪酶在手性拆分上的潜在应用

重组脂肪酶对(±)-MPGM手性拆分结果见表3。2h后转化率达到37.2％，4h后转换达47.3％，ee值为89.7％，得到了高纯度的(2R，3S)-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，即(-)-MPGM，它是地尔硫(艹卓)生产中必要的中间体。此外，S.marcescens脂肪酶也可被用于其他消旋混合物拆分，包括乙酸薄荷酯、丁酸缩水甘油酯、异丙叉醋酸酯、2-苯基-1-丙醇和(S)-氟吡洛芬等，这使得S.marcescens脂肪酶在药物手性拆分领域有着更广的应用前景。

3　结论

成功地克隆了S.marcescens ECU1010的脂肪酶基因，优化实现了可溶性表达，酶活性达到8 612.3 U/L。重组脂肪酶最适温度为30℃，最适pH9.0，在低于30℃，pH值范围为6.0～6.8条件下比较稳定。它能被Ca2+显著激活，对硝基苯月桂酸酯呈现出最大的活性。脂肪酶对(±)-MPGM具有手性拆分作用，为生物催化大量制各地尔硫(艹卓)提供了可能。