掌叶蜂斗菜中蜂斗菜内酯―D的抗炎和抗过敏作用研究

摘 要：本文旨在研究掌叶蜂斗菜提物取物对过敏反应及炎症的影响， 为其临床治疗过敏性哮喘提供药理学依据。主要通过硅胶柱色谱技术从掌叶蜂斗菜叶片中得到蜂斗菜内酯-D；采用抗原诱导的RBL-2H3 细胞活化脱颗粒模型，测定蜂斗菜内酯-D对β-HEX的影响；通过 OVA 诱导和激发 BALB/c 小鼠，构建哮喘小鼠模型，并对支气管灌洗液（BALF）中炎症细胞计数和分类计数，观察蜂斗菜内酯-D的抗过敏、抗炎作用。结果表明0.1-10ug/ml蜂斗菜内酯-D对β-HEX抑制率分别为 26.82%、34.1%、44.25%、61.32%，可见蜂斗菜内酯-D在此剂量内能够较明显抑制抗原诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒的β-HEX释放，抑制率与浓度相关；通过分析BALF中炎症细胞的数量， 蜂斗菜内酯-D治疗组与模型对照组相比，能有效抑制BALF中炎症细胞的数量（P

关键词：蜂斗菜内酯-D； 抗炎； 抗过敏

中图分类号：Q949.783.5 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20150932001

掌叶蜂斗菜（Petasites tatewakianus Kitam.）是菊科蜂斗菜属植物，国内资源比较丰富。主要分布于小兴安岭、长白山地区。蜂斗菜属植物已经被证实具有很好的抗炎、抗过敏作用[1-3]。其中 蜂斗菜（Petasites japonicus （Sieb. et Zucc.）Maxim）地上部分提取物已被证实具有抗过敏和抑制肥大细胞脱粒作用[4]。同属植物欧蜂斗菜（Petasites hybridus），在欧洲应用历史悠久，其根茎中的内酯类提取物已用于治疗哮喘[5-6]。蜂斗菜属主要有效成分是倍半萜类化合物，研究表明，蜂斗菜素和硫蜂斗菜素等倍半萜类化合物具有抗组胺，阻止白三烯合成，使细胞内钙离子浓度降低的作用，从而达到对炎症和痉挛的治疗作用。本研究力图鉴定掌叶蜂斗菜叶片中的主要活性成分，并检测其抗炎、抗过敏作用，为掌叶蜂斗菜临床应用提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料

掌叶蜂斗菜采自吉林省白山市浑江区大镜沟乡经鉴定为蜂斗菜属植物掌叶蜂斗菜（Petasites tatewakianus Kitam.）

1.1.2 试剂及药物

200-300目硅胶，青岛海洋化工。乙醇、正己烷、乙酸乙酯，国药生产；Gibco RPMI 1640 培养基（美国 Invitrogen 公司，）；胎牛血清（上海玉博生物科技有限公司）； 抗-DNP IgE 单抗、4-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（Amresco公司）；二硝基苯基化牛血清白蛋白（美国 Biosearch Technologies 公司）；富马酸酮替芬（美国 Sigma 公司）；OVA（鸡卵球蛋白V级）购于sigma公司（美国）；其它如无特别说明为国产分析纯。

1.1.3 实验动物及细胞

实验动物SPF级4-6周龄BALB/c雌性小鼠，中国医学科学院实验动物研究所，合格证号：SCXK（京）2013-0078，RBL- 2H3细胞（美国ATCC）。

1.1.4 仪器

RE52-98型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；激光共聚焦显微镜（L8681074， NiKon，日本）；倒置显微镜（ZKD一3，OLYMPUS，日本）；台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司；CO2 培养箱（上海西域机电系统有限公司，型号：KB53）；超净工作台（上海西域机电系统有限公司，型号：SW-CJ-1D）。

1.2 实验方法

1.2.1 蜂斗菜内酯-D的分离

掌叶蜂斗菜新鲜叶片（3000g）搅拌粉碎，75%乙醇室温提取。旋转蒸发回收乙醇，剩余水溶部分分别用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取。正己烷层真空干燥得提取物（100.5g），硅胶柱色谱，以正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，薄层色谱监测，洗脱液合并，将第3份硅胶柱色谱分离，以正己烷-乙酸乙酯5：1洗脱，薄层色谱监测，合并洗脱液，经重结晶得化合物。

1.2.2 细胞培养

RBL-2H3贴壁细胞用做实验细胞，RPMI-1640 培养液（含 10% 胎牛血清，100?g / mL 青霉素，100 ?g/mL 链霉素），培养温度37℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞，台盼蓝排斥染色，活细胞率>95%。

1.2.3 蜂斗菜内酯-D对抗原诱导的RBL-2H3 细胞活化脱颗粒 β-HEX 释放的影响

实验分组：正常组、模型组、给药组、药物阴性对照组、富马酸酮替芬阳性对照组。 其中，给药组和药物阴性对照组分别由蜂斗菜内酯-D 0.1、1、10、100ug/ml 四个浓度组成；富马酸酮替芬 100ug/ml作为阳性对照药组。将处于对数生长期的 RBL-2H3 细胞从培养箱中取出，进行细胞消化并制备成细胞悬液。用培养基调整细胞数至 2.5×105 /mL，每孔 1000μL 接种于 24 孔培养板中，在37℃ 5% CO2培养箱中培养。按已定方法分组后，每孔加入 0.25?g/mL 的抗DNP-lgE 单抗致敏孵育过夜。次日，各浓度的药物加至给药组及药物阴性对照组中预孵育1h，用等量RIPM1640培养基替代加至正常组、模型组。1h后，用PIPES缓冲液清洗细胞 3 次。每孔加入 200μL PIPES缓冲液（含25ng/mL 的 DNP-HSA）至模型组及给药组，用等量缓冲液替代加至正常组和药物阴性对照组，37℃孵育1 h，刺激细胞 β-HEX 的释放。每组上清各取 50μL，加入到 96 孔培养板中，取50μL显色液加入，37℃孵育 1h。加入 200μL 碳酸钠缓冲液终止反应，在405nm 波长下检测 OD 值。β-HEX 释放抑制率计算：β-HEX 抑制率（%）=[1-（TOD-BOD-NOD）/（COD-NOD）] ×100%。

1.2.4 支气管哮喘小鼠模型的建立及BALF中炎症细胞计数和分类计数

雌性，4～6周龄，Balb/c小鼠， 18只 ，随机分为阴性对照组、药物对照组、OVA模型组和药物治疗组。始终给予PBS液处理阴性对照组，在第0，1，2天， 给予阴性对照组和药物对照组小鼠腹腔注射PBS 0.2ml/只，给予OVA模型组和药物治疗组小鼠腹腔注射100ug OVA+ 2mgAl（OH）3，在第5～11d，给予阴性对照组和OVA模型组小鼠每只每天腹腔注射0.2ml PBS液，药物对照组和药物治疗组腹腔注射蜂斗菜内酯-D（1mg/kg PBS溶解），在第14、15、19d，乙醚麻醉小鼠后， OVA滴鼻激发，最后一次滴鼻后48小时处死小鼠，取血，支气管肺泡灌洗（BALF），回收支气管肺泡灌洗液，记录回吸收量；取BALF 500g，37℃，离心5min，取离心后的沉淀细胞，用1mL PBS重悬细胞，进行计数；细胞悬液涂片，染色液染色，计数200个细胞，进行细胞分类计数。

2 实验结果

2.1 蜂斗菜内酯-D鉴定

化合物白色针状结晶，经EI-MS（m/z）、IR（KBr，cm-1）、1HNMR（500MHz，CDCL3） 、13CNMR和DEPT数据分析，比较文献[7] ，确认化合物为蜂斗菜内酯-D（Bakkenolide-D）。

2.2 蜂斗菜内酯-D对抗原诱导 RBL-2H3 细胞活化脱颗粒 β-HEX 释放的影响

根据相应的β-HEX释放抑制率的公式计算所得0.1～100ug/L蜂斗菜内酯-D的抑制率分别为26.82%、34.1%、44.25%、61.32%。这表明该剂量范围内的蜂斗菜内酯-D对抗原诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒的β-HEX释放具有较明显的抑制作用，抑制作用强弱与浓度相关，如图1。其中阳性对照药富马酸酮替芬β-HEX释放抑制率为63.0%。结果显示100ug /ml的蜂斗菜内酯对β-HEX释放的抑制作用很明显，可与阳性药物富马酸酮替芬的抑制作用相媲美。

图1 蜂斗菜内酯-D（0.1-100ug/ml）对抗原诱导RBL-2H3细胞活化脱粒β-HEX释放的影响结果以均值±SD表示（n=3）。实验重复3次。

2.3 蜂斗菜内酯-D对过敏性哮喘小鼠支气管肺泡灌液（BALF）中炎症细胞抑制作用

通过分析BALF中炎症细胞的数量，进一步观察蜂斗菜内酯-D对过敏性哮喘小鼠支气管肺泡灌液（BALF）中炎症细胞的抑制作用。如图2显示， 空白对照组与单独蜂斗菜内酯-D组无明显差异，蜂斗菜内酯-D治疗组与模型对照组相比，能有效抑制BALF中嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的数量（P

3 讨论

炎症，就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症性疾病在临床上较常见，如外伤感染及各种传染病等。过敏反应是指已免疫的机体在再次接受相同物质的刺激时所发生的反应。反应的特点是发作迅速、反应强烈、消退较快；一般不会破坏组织细胞，也不会引起组织损伤，有明显的遗传倾向和个体差异。临床研究表明炎症与过敏反应具有一定相关性，密不可分，通常情况下具有过敏体质的机体对抗原性物质发生过敏反应，同时会出现相应部位的急性和慢性炎症病理反应。如临床常见的过敏性炎症疾病过敏性鼻炎、慢性支气管炎、哮喘、过敏性皮炎等。蜂斗菜属植物主要成分为倍半萜内酯类化合物[8-9] ，张福金等从此属植物中分离的蜂斗菜内酯类倍半萜化合物，具有抗卵清蛋白诱导的大鼠过敏性鼻炎作用，并能降低血清中组氨酸和白介素水平，减少鼻粘膜中嗜酸性粒细胞的浸润和大鼠搔鼻次数[3]。另有文献报导蜂斗菜提取物具有抗Ⅰ型过敏、抑制肥大细胞脱粒和对卵清蛋白诱导的小鼠肺炎模型中气道炎症的抑制作用[2，4]。

本研究为对掌叶蜂斗菜的主要成分蜂斗菜内酯-D的药理作用进行研究，进一步揭示蜂斗菜内酯抗炎、抗过敏作用的相关性及物质基础。采用抗原诱导 RBL-2H3 细胞活化脱颗粒模型，观察蜂斗菜内酯-D对β-HEX释放的影响；采用卵清蛋白诱导的哮喘小鼠模型，观察蜂斗菜内酯-D对支气管肺泡灌液（BALF）中炎症细胞抑制作用。结果发现0.1-100ug/ml蜂斗菜内酯-D的抑制率分别为26.82%、34.1%、44.25%、61.32%，在研究剂量范围内的蜂斗菜内酯-D对抗原诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒的β-HEX释放具有较明显的抑制作用，抑制作用强弱与浓度相关；蜂斗菜内酯-D治疗组与模型对照组相比，能有效抑制BALF中嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的数量。综上所述，蜂斗菜内酯-D具有明显的抗炎、抗过敏作用，为其临床使用提供药理学依据。

参考文献

[1]Fiebich，B.L.，Grozdeva，M.，Hess，S.，Hull，M.，Danesch，U.，Bodensieck，A.，Bauer，R.， Petasites hybridus extracts invitroinhibit COX-2 and PGE2 release by direct interaction with theen meand by preventing p42/44 MAP kinase activation in rat primary microglial cells[J].PlantaMedica，2005（71）：12C19.

[2]Lee，J.S.，Yang，E.J.，Yun，C.Y.，Kim，D.H.，Kim，I.S..Suppressiveeffectof Petasites japonicus extraction ovalbumin -induced airway inflammation inanasthmatic mouse model[J].Journal of Ethnopharmacology，2011（133）：551C557.

[3]Zhang，F.J.，Wang，Q.，Wang，Y.，Guo，M.L..Anti-allergic effectsof total bakkenolides from Petasitestricholobus in ovalbumin-sensitizedrats[J].Phytother- apyResearch，2011（25）：116C121.

[4]Shimoda，H.，Tanaka，J.，Yamada，E.，Morikawa，T.，Kasajima，N.，Yoshikawa，M. Anti type I allergic property of Japanese butterbur extract and its mast cell degranulation inhibitory ingredients[J]. Journal of Agricultural and Food Chem- istry ，2006（54）：2915C2920.

[5]Danesch， U.C.. Petasites hybridus （Butterbur root）extractinthetreatmentof asthma―an opentrial[J]. Alternative Medicine Review，2004（9）： 54C62.

[6]Brattstrom，A.，Schapowal，A.，Maillet，I.，Schnyder，B.，Ryffel，B.，Moser，R. Petasites extract Ze339（PET） inhibits allergen-induced Th2 responses，airway inflammation and airway hyper reactivity in mice[J]. Phytotherapy Research，2010（24）：680C685.

[7]Forth W et al. Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie. 8. Aufl. Urban & Fischer， München. Jena 2001

[8]Liao，C.H.，Ko，F.N.，Wu，T.S.，Teng，C.M..BakkenolideG，anaturalPAF-receptor antagonist[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology，1997（49）：1248C1253.

[9]Wu，T.S.，Kao，M.S.，Wu，P.L.，Lin，F.W.，Shi，L.S.，Liou，M.J.，Li，C.Y..The bakkenolides from the root of Petasites for mosanus and their cytotoxicity[J]. Chemical andPharmaceuticalBulletin.1999（47）：375C382.

作者简介：李余先（1979-），男，博士，讲师，研究方向：中药学。