谈盐度对金鲳酶活力的影响

1抗氧化酶活力测定方法

超氧化物歧化酶(SOD):采用黄嘌呤氧化酶法进行测定，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2•)自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光度计测定(波长550nm)吸光度。酶活力单位定义为:每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U/mg)。数据处理实验数据用Spss18.0进行单因素方差分析(One-WayANOVA)，并采用Duncan法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。数据结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用Excel2007作图。

2结果

2.1不同盐度下肝抗氧化酶活力超氧化物歧化酶(SOD)不同盐度处理下卵形鲳鲹肝SOD活力变化见图1A。对于不同盐度同一时间抗氧化酶活力:24h和48h时，3个盐度处理组酶活力均极显著低于对照组(P＜0.01);72h时，盐度10和40处理组酶活力极显著高于对照组(P＜0.01)，盐度20处理组酶活力极显著低于对照组(P＜0.01);120h时，除盐度10处理组酶活力与对照组差对于不同时间同一盐度组酶活力:盐度10处理酶活力呈现波动变化，最大值出现在72h(P＜0.01);盐度20处理组酶活力总体呈现逐渐升高的趋势;对照组(盐度30)各时间点酶活力差异不显著(P＞0.05);盐度40处理组酶活力最大值出现在72h(P＜0.01)，酶活力总体呈现先升高后下降的趋势，120h时酶活力降到最低点。过氧化氢酶(CAT)不同盐度处理下卵形鲳鲹肝CAT活力变化见图1B。对于不同盐度同一时间抗氧化酶活力:24h时，盐度10处理组酶活力极显著高于对照组(P＜0.01)，盐度20和40处理组酶活力与对照组之间差异不显著(P＞0.05);48h时，盐度10和盐度40处理组与对照组酶活力不存在显著差异(P＞0.05)，盐度20处理组酶活力极显著低于对照组(P＜0.01);72h时，盐度10处理组酶活力极显著高于对照组(P＜0.01)，盐度20处理组酶活力与对照组差异不显著(P＞0.05)，盐度40处理组酶活力低于对照组(P＜0.05);120h时，各处理组酶活力均与对照组不存在显著差异(P＞0.05)。对于不同时间同一盐度组酶活力:盐度10处理组酶活力呈现波动变化，最大值出现在72h(P＜0.05);盐度20处理组酶活力总体呈现先下降后升高的趋势，最小值出现在48h(P＜0.05);对照组各时间点酶活力差异不显著(P＞0.05);盐度40处理组酶活力随处理时间的延长逐步下降。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)不同盐度处理下卵形鲳鲹肝GPX活力变化见图1C。对于不同盐度同一时间抗氧化酶活力:24h时，盐度10和20处理组酶活力极显著低于对照组(P＜0.01)，盐度40处理组酶活力显著高于对照组(P＜0.05);48h时，盐度10处理组酶活力低于对照组(P＜0.05)，盐度20处理组酶活力与对照组没有显著差异(P＞0.05)，盐度40处理组酶活力极显著高于对照组(P＜0.01);72h时，盐度10处理组酶活力极显著高于对照组(P＜0.01)，其他两个处理组酶活力与对照组没有显著性差异(P＞0.05);120h时，盐度10和20处理组与对照组无显著差异(P＞0.05)，盐度40处理组酶活力极显著低于对照组(P＜0.01)。对于不同时间同一盐度组酶活力:各盐度处理组酶活力均呈现先升高后下降的趋势。盐度10处理组，酶活力最大值出现在72h(P＜0.01)，最小值出现在24h(P＜0.01);盐度20处理组，24h时酶活力最低(P＜0.01)，48h和72h酶活力差异不显著(P＞0.05)，但是均显著高于120h(P＜0.05);对照组之间各时间点酶活力没有明显变化(P＞0.05);盐度40处理组，酶活力在120h时达到最低(P＜0.01)。

2.2不同温度下肝抗氧化酶活力超氧化物歧化酶(SOD)不同温度处理下卵形鲳鲹肝SOD活力变化见图2A。当温度由24.6℃下降到18.0℃时，各取样时间点酶活力均显著高于对照组(P＜0.05)。当温度由24.6℃下降到21.0℃时，各取样时间点酶活力均极显著高于对照组(P＜0.01)。当温度由24.6℃升高到29.0℃时，0h、1h、3h和24h时处理组酶活力极显著高于对照组(P＜0.01)，6h时与对照组没有显著差异(P＞0.05)，12h时处理组酶活力极显著低于对照组(P＜0.01)。当温度由24.6℃升高到32.0℃时，除3h时酶活力显著低于对照组外(P＜0.05)，其他时间点酶活力均要极显著低于对照组(P＜0.01)。过氧化氢酶(CAT)不同温度处理下卵形鲳鲹肝CAT活力变化见图2B。当温度由24.6℃下降到18.0℃时，0h和6h时酶活力显著低于对照组(P＜0.05)，1h和3h时酶活力与对照组不存在显著差异(P＞0.05)，到12h和24h时酶活力极显著高于对照组(P＜0.01)。当温度由24.6℃下降到21.0℃时，0h时酶活力极显著低于对照组(P＜0.01)，1h和24h与0h时结果相反，其余取样时间点酶活力与对照组无显著差异(P＞0.05)。当温度由24.6℃升高到29.0℃时，0h和3h时与对照组没有显著差异(P＞0.05)，1h和24h时酶活力极显著高于对照组(P＜0.01)，其他两个取样时间点酶活力极显著低于对照组(P＜0.01)。当温度由24.6℃进一步升高到32.0℃时，各取样时间点酶活力均极显著低于对照组(P＜0.01)。

3讨论

3.1盐度对卵形鲳鲹肝抗氧化酶活力的影响盐度变化与鱼体自由基的产生有关，当鱼体由低盐度进入高盐度，或者从高盐度进入低盐度，必定会经历一个渗透压的调节过程，从而引起能量的大量消耗(Boeufetal．2001，Yeetal．2009)，其结果是加速鱼体新陈代谢，产生大量自由基，从而导致鱼体处于氧化应激(oxidativestress)状态。所谓氧化应激是指鱼体自由基的骤然增多打破了自由基原有的动态平衡，最终对细胞成分造成破坏的过程(Lushchak2011)。鱼体内抗氧化酶对于自由基的清除有着重要意义。SOD可以把超氧化物阴离子(O2•)还原为过氧化氢(H2O2)，H2O2可以进一步被CAT分解为H2O和O2(Filhoetal．2001)。GPX以谷胱甘肽为底物，主要功能也是清除H2O2，同时还可以清除脂质过氧化物。本研究中，当盐度由30降低至10时，对抗氧化酶活力产生了明显的影响。24h时，CAT活力高于对照组，SOD和GPX活力均要低于对照组。这与孙鹏等(2010)对条石鲷(Oplegnathusfasciatus)在低盐度下(8和18)24h时抗氧化酶活力的研究结果一致。而尹飞等(2011)对银鲳(Pampusargenteus)的研究结果则表明，在盐度10处理24h时，GPX和SOD活力升高，CAT活力反而下降，这与本研究以及孙鹏等(2010)的研究结果存在差异，推测这是由于不同鱼类对于盐度的耐受性差异造成的。通常情况下，抗氧化酶活力升高说明机体产生了大量自由基(Rossetal．2001)。赵峰等(2008)的研究表明，盐度变化抑制了施氏鲟(Acipenserschrenckiii)肝SOD和CAT活力，但是随着驯化时间的延长，抗氧化酶活力有所恢复，并认为这与鱼体的渗透压调节过程有关。可见，在盐度变化过程中，开始阶段由于渗透压的调节，对鱼体的新陈代谢造成较大影响，SOD和GPX活力受到抑制，而CAT活力受到激发，说明在盐度变化过程中不同酶被激活或抑制具有一定的时序性，这与尹飞等(2011)得出的结果相似。随着胁迫时间的延长，渗透压的变化对鱼体产生的影响进一步加剧，从而造成CAT活力在48h明显下降。在72h时，鱼体对盐度10适应性增强，为了防止氧化应激对鱼体的损伤，3种抗氧化酶活力升高，以清除体内积累的自由基，最后，鱼体恢复到体内自由基的动态平衡状态，抗氧化酶活力恢复到正常水平。当盐度由30降低至20时，CAT活力在24h维持在正常水平，48h时明显低于对照组，而GPX活力与CAT相反，二者活力呈现互补。这与Wang等(2008)对斑节对虾(Penaeusmonodon)在低盐度下研究结果一致，表明GPX和CAT在清除自由基过程中发挥着相互补充的作用，同时也存在着一定的竞争。但是随着驯化时间的延长，盐度20处理组并未出现酶活力显著升高的现象，SOD活力依旧维持在较低水平，CAT和GPX与对照组没有显著差异。一般情况下，Na+-K+-ATPase活力在等渗点处最低，从而其活力随盐度变化呈现“U”型(徐力文等2007)。范春燕等(2012)研究了盐度胁迫对卵形鲳鲹幼鱼Na+-K+-ATPase活力的影响，结果表明在盐度20时其酶活力最低，并认为卵形鲳鲹等渗点可能在盐度20左右。同时，区又君(2008b)也指出，在盐度20以下，卵形鲳鲹生长迅速，而在等渗点附近用于渗透压调节方面消耗的能量较少，从而有利于鱼体的生长。卵形鲳鲹在咸淡水中的生长速度快于海水，因此，笔者认为，盐度20可能更接近于卵形鲳鲹的等渗点，在维持渗透压平衡方面无需消耗额外的能量，从而减少了自由基的产生。因此，酶活力只需维持在较低或正常水平就可以保证鱼体自由基的动态平衡。同时，盐度20比盐度10更加接近对照组(盐度30)的盐度，这也可能是造成其酶活力变化明显不同于盐度10处理组的原因之一。当盐度由对照组的30升高到40时，24h和48h时，CAT活力与对照组相比变化不明显，GPX活力明显升高，说明鱼体内产生了大量脂质过氧化物，需要GPX来快速清除，进而维持细胞膜的正常功能(孙鹏等2010)。大量脂质过氧化物对细胞正常功能的影响可能是造成SOD活力下降的重要原因。在72h时，伴随着脂质过氧化物的清除，SOD活力明显升高，鱼体产生了大量的H2O2。而此时CAT活力显著下降，GPX活力也下降到正常水平。随着胁迫时间的进一步延长，120h时，3种抗氧化酶活力均低于对照组。区又君(2008b)研究表明卵形鲳鲹在高盐度海水中生长较差。本实验的研究发现，盐度40组卵形鲳鲹死亡率为6.67%，而其他盐度未出现死亡。孙鹏等(2010)对条石鲷的研究中也出现了在高盐度下酶活力显著降低的情况。根据研究结果推断，一定程度的高盐度刺激对抗氧化酶的活力起到了激活作用，但是随着胁迫时间的延长，鱼体的生理机能受到较大影响，甚至已经造成机体损伤，新陈代谢活动降低，最终导致抗氧化酶活力被抑制。综上所述，卵形鲳鲹幼鱼对低盐度的耐受能力较强，可以通过改变体内抗氧化酶活力来维持体内自由基的动态平衡。但是在高盐度下，随着胁迫时间的延长抗氧化酶活力明显下降，导致鱼体免疫力降低，在实验过程中存活率低于其他盐度组。因此，在卵形鲳鲹养殖中，可以通过适当降低水体盐度以达到更好的养殖效果。

3.2温度对卵形鲳鲹抗氧化酶活力的影响本研究中，在0h时，各温度处理组SOD和CAT活力和对照组差异明显，推测是由于温度的骤然变化对鱼体代谢造成了较大的影响，说明卵形鲳鲹对于温度的变化是极为敏感的。低温处理组(18.0℃和21.0℃)SOD活力一直高于对照组，CAT活力到实验结束同样要高于对照组。郭黎等(2012)对17～28℃条件下大菱鲆(Scophthalmusmaximus)肝SOD研究发现，17℃时其活力最高，但是CAT活力最低。对锯缘青蟹(Scyllaserrata)低温驯化后发现，低温处理组SOD和CAT活力要高于对照组，认为这是由于在低温条件下产生的活性氧需要更多的SOD和CAT来清除，因而抗氧化酶活力升高(孔祥会等2007)。Malek等(2004)认为这主要是由于低温增加机体自由基的产生或者低温减慢了自由基的清除造成的，但其机理尚不清楚。对锯缘青蟹的研究还发现5℃处理组丙二醛含量明显高于对照组，表明锯缘青蟹处于氧化应激状态(孔祥会等2007)。据此推测，尽管低温条件下抗氧化酶活力最终可以维持在较高水平，但当其活性增加不足以清除鱼体产生的自由基时，仍可使鱼体处于氧化应激状态，这可能是卵形鲳鲹耐低温能力差的重要原因之一。卵形鲳鲹的适温范围为16～36℃，在适温范围内鱼体耗氧率随温度的升高而升高，从而产生更多的自由基，因此当温度突变到29.0℃时为了防止氧化损伤，SOD活力在1～3h以及CAT活力在1h时明显高于对照组。这可视为鱼体新陈代谢的适应(刘伟成等2006)。杨健等(2007)的研究发现，军曹鱼(Rachycentroncanadum)肝SOD和CAT活力随温度(26～32℃)升高而升高;强俊等(2012)的研究发现，尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)肝SOD和CAT在28～31℃时活力较高。可见，29℃也更有利于SOD和CAT活力的表达。但是在6～12h时，SOD和CAT活力都明显低于对照组。Lushchak等(2006a，b)对金鱼(Carassiusauratus)的研究也发现，在开始阶段高温促进了SOD和CAT的活性，但在胁迫4h后抗氧化酶活力显著下降。这可能与高温对鱼体造成了较大的氧化压力有关(徐冬冬等2010)。在24h时，SOD和CAT活力明显高于对照组，表明在29.0℃处理下随着胁迫时间的延长，卵形鲳鲹幼鱼最终可以通过增加抗氧化酶活力来清除体内大量产生的自由基。当温度由24.6℃骤变到32.0℃时，SOD和CAT活力一直明显低于对照组。这与徐冬冬等(2010)对褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)的研究结果一致。推测这主要是由于在32.0℃高温条件下鱼体内自由基增加较多，抗氧化酶活力不足以抑制细胞内的氧化损伤，进而导致抗氧化酶活力下降。综上所述，适当的温度变化可以增加卵形鲳鲹幼鱼抗氧化酶活力，在温度降低时可以通过加强鱼体抗氧化能力来提高其对低温的适应性。温度过高时抗氧化酶活力受到抑制。但由于本实验时间较短，有关温度变化对卵形鲳鲹抗氧化酶活力的长期影响有待进一步研究。

作者：刘汝建 区又君 李加儿 苏慧 曹守花 王永翠 单位：中国水产科学研究院南海水产研究所 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室 上海海洋大学水产与生命学院