金线莲茎腐病菌的生物学特性及5种杀菌剂对其抑制作用

[摘要] 采用十字交叉法和血球计数板法分别测定不同培养温度、pH和光照条件对金线莲茎腐病菌菌丝生长状况和产孢量的影响；用菌丝生长速率法测定5种杀菌剂对金线莲茎腐病菌的抑制作用，为金线莲茎腐病的防治提供参考。结果表明该病菌菌丝生长、产孢的最适温度都为28 ℃，最适生长的pH为6～7，且光暗交替可促进菌落的生长和产孢。在5种杀菌剂中，戊唑醇乳油的EC50为10.02 mg·L-1，为多菌灵的92.50倍；其次是腈菌唑和福星乳油，EC50分别为91.23，96.68 mg·L-1。戊唑醇乳油对金线莲茎腐病菌的抑制作用最强，防治效果较好。

[关键词] 金线莲；茎腐病菌；生物学特性；杀菌剂；毒力测定

[收稿日期] 2013-09-16

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81303167）；浙江省自然科学基金项目（LY13H280010）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201310341020）

[通信作者] 邵清松，博士，副教授，主要从事药用植物栽培与育种研究，Tel：（0571）63741273，E-mail：

金线莲Anoectochilus roxburghii又名金线兰、金丝草，为兰科开唇兰属多年生名贵中药材，主产于福建、浙江、台湾、江西、贵州等地，具有清热凉血、除湿解毒等功效，用于治疗糖尿病、肾炎、急慢性肝炎等症，在民间享有“药王”的美称[1-3]。由于金线莲自然繁殖率低，对生态环境要求严格，适应性较差，加之人工过度采挖，使得野生资源锐减。近年来许多学者对金线莲人工栽培进行研究，在种苗培育、组培苗移栽和设施栽培等关键技术取得突破性进展[4-5]。金线莲茎腐病是由尖孢镰刀菌从茎基部侵染引起的，病菌经由表皮、根毛或根茎侵入金线莲茎基部，是人工栽培中主要的病害之一[6]。该病菌对金线莲不同生育期皆可造成危害，其危害程度依株龄提高而递减，依病原菌浓度及温度上升而增加[7]。发病时植株茎基部出现黄褐色水渍状病斑，很快发展至绕茎一周，病部组织腐烂干枯溢缩呈线状。病势发展迅速，幼苗迅速倒伏死亡，出现猝倒现象，发生严重时为害率达90%，给种植户带来巨大的经济损失[6]。

国内外关于金线莲茎腐病综合防治研究报道较少。潘国祥[8]研究表明在金线莲培养基中添加钙化合物，能降低金线莲茎腐病发病率15%，且能有效的增加植株的株高和鲜重。张淑芬等[9]利用栽培基质混拌木霉菌AHS06菌株，喷施AHS06菌株分生孢子制剂、Streptomyces saraceticus 31制剂等方法防治金线莲茎腐病。蔡金池[10]研究发现TA 菌株孢子悬浮液处理，能诱导金线莲后天系统抗病性反应，从而提高其防治茎腐病的能力。然而，目前生产上对该病害仍以化学防治为主， 常用多菌灵、百菌通、代森锰锌和甲基托布津等杀菌剂， 因连续多年使用这些药剂，防治效果逐年降低，甚至达到无法控制的程度[11-12]。本研究对金线莲茎腐病进行病原菌分离鉴定，并对其生物学特性、药剂毒力进行研究，以期为全面了解和深入研究金线莲茎腐病菌的发生规律和科学防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 药剂与菌株

1.1.1 供试药剂 50%多菌灵可湿性粉剂（四川国光农化股份有限公司），40%福星乳油（氟硅唑，美国杜邦公司），72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂（华北制药股份有限公司），25%戊唑醇乳油（上海艾科思生物药业有限公司），40%腈菌唑可湿性粉剂（江门市大光明农化有限公司）。

1.1.2 供试菌株 从浙江农林大学百草园采集金线莲染病植株，参照张争等方法[13]，从茎部病健交界处切取组织，剪成小块，放入70%乙醇消毒30 s，然后将其转入0.1%升汞消毒1 min，用无菌水清洗3遍后，用灭菌滤纸吸干，置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上。在28 ℃黑暗条件下培养，当菌落在培养基长出后，用灭菌的接种针挑取菌落边缘的菌丝进行病原菌的初步纯化，将纯化后的菌株，再进行单孢分离，在PDA 试管斜面中培养好后，于4 ℃冰箱中保存备用。纯化后的菌种培养5 d后镜检菌丝、孢子的形态，并进行病原菌鉴定[14]。

1.2 菌株致病性的测定

采用针刺接种法对分离到的金线莲茎腐病菌菌株进行致病性测定[15]。取金线莲同一茎位的茎段，用微量进样器针头刺破表皮，将直径2 mm的菌丝块接种于针刺点上，同时以接种空白培养基为对照。共接种15个茎段，接种处理完后放置于28 ℃保湿培养，3 d 后观察并记录发病情况。

1.3 金线莲茎腐病菌生物学特性观察

1.3.1 温度对金线莲茎腐病菌菌丝生长和产孢的影响 将直径为4 mm的病原菌菌块接种到PDA平板中央，分别置于5，15，25，28，35，40 ℃ 等6个不同温度梯度下培养，每个处理重复4次，第5天采用十字交叉法[16]测量菌落直径，第10天用血球计数板法[17]测产孢量（以下同）。

1.3.2 pH对金线莲茎腐病菌菌丝生长和产孢的影响 用1.0 mol·L-1的盐酸或氢氧化钠溶液将PDA 培养基分别调至pH为 3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，自菌落边缘打取直径4 mm的菌饼，接入不同pH的培养基上，每个处理重复4次，28 ℃下培养5 d，测量菌落直径，比较pH对菌株生长的影响，第10天测产孢量。

1.3.3 光照对金线莲茎腐病菌菌丝生长和产孢的影响 将直径为4 mm 的病原菌菌块接种到PDA平板中央，28 ℃下分别置于①全程暗处理；②光暗交替处理，12 h光照，12 h黑暗；③全程光照处理；每个处理重复4次，第5天测量菌落直径，比较光照对菌株生长的影响，第10天测产孢量。

1.4 5种杀菌剂对金线莲茎腐病菌的抑制作用测定

采用菌丝生长速率法[18]测定5 种杀菌剂对金线莲茎腐病菌的抑制作用。将金线莲茎腐病菌于PDA 培养基上28 ℃预培养5 d，用直径4 mm 的打孔器在靠近菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，接种到含有不同药剂浓度的培养基平板上（50%多菌灵可湿性粉剂：1 667，1 250，1 000，833，667 mg·L-1；40%福星乳油：200，100，66.7，50，40 mg·L-1；72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂：500，400，333.3，285.7，250 mg·L-1；25%戊唑醇乳油 80，40，20，10，5 mg·L-1；40%腈菌唑可湿性粉剂 166.7，125，100，83.3，71.4 mg·L-1），每皿1片，置于28 ℃恒温箱内培养5 d，用十字交叉法测定各处理的菌落生长直径，以清水为对照，每浓度处理重复4次。测定菌落直径，确定药剂对病原菌菌丝生长的抑制率。通过菌丝生长抑制概率值和药剂浓度对数值之间的线性回归分析，求出各药剂对菌株的有效抑制中浓度（ EC50） [19]。试验数据由SPSS 16.0软件进行数据分析。

菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%

2 结果与分析

2.1 病原菌鉴定

在PDA培养基上培养5 d 后，肉眼观察菌落形态，发现其菌丝体具有条纹，呈绒毛状。插片法显微观察，发现小型分生孢子较多，呈卵圆形至纺锤形，大型分生孢子无色，呈镰刀形， 略弯曲，两端稍尖，多数有3个隔膜。厚垣孢子在菌丝侧枝上顶生，近圆形，卵黄色，表面光滑，单生或串生（图1）。依据Booth′s镰刀菌分类鉴定标准[20]确认该菌为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum。

2.2 致病性测定

挑取2 mm的菌丝块接种于新鲜离体茎段，发病率为92%，对照发病率为0。发病材料病斑不规则形，黄褐色，呈水渍状。与田间发病金线莲植株茎段症状一致，且从这些病斑上都能够再分离到与原接种菌株相同的茎腐病菌。

2.3 病原菌生物学特性观察

2.3.1 温度对金线莲茎腐病菌菌落生长和产孢的影响 不同温度试验结果表明，金线莲茎腐病菌菌丝生长的温度是5～40 ℃，最适生长温度为28 ℃，28 ℃温度条件病菌培养5 d菌落平均直径最大为78 mm，低于5 ℃或高于40 ℃，菌丝均不能正常生长。该菌产生分生孢子的温度为5～40 ℃，最适产孢温度为28 ℃，产孢量为1.42×108个/皿（图2）。

2.3.2 pH对金线莲茎腐病菌菌落生长和产孢的影响 不同pH条件试验结果表明，金线莲茎腐病菌在pH 3～12的PDA培养基上均能生长，最适生长的pH为6～7，在pH 7的PDA培养基上培养5 d后，菌落平均直径最大为72 mm。金线莲茎腐病菌在pH 3～12 PDA培养基上均能产孢，但酸性条件更适宜其产孢，pH 3～5时产孢量最大（图3）。

2.3.3 光照对金线莲茎腐病菌菌丝生长和产孢的影响 不同光照条件试验结果表明金线莲茎腐病菌菌丝生长和产孢量在全程光照、光暗交替和全程暗处理下有相似的变化情况。病原菌在光暗交替条件下生长最快，产孢量也最大，菌落直径为72 mm，产孢量为1.16×108个/皿；其次为全黑暗条件，菌落直径为68 mm，产孢量9.6×107个/皿；在全程光照处理条件下生长最慢，菌落直径为 64 mm，产孢量为8.4×107个/皿（图4）。

2.4 5种杀菌剂对金线莲茎腐病菌的抑制作用

5种杀菌剂对金线莲茎腐病菌菌丝生长的抑制作用差异较大（表1），其中25%戊唑醇乳油抑制作用最高，EC50为10.02 mg·L-1，为50%多菌灵的92.5倍；其次为40%腈菌唑和40%福星乳油，EC50分别为91.23，96.68 mg·L-1，为50%多菌灵的10.16，9.59倍；72%农用硫酸链霉素抑制作用较小，EC50为280.50 mg·L-1，为50%多菌灵的3.30倍。

3 讨论与结论

依据Booth′s镰刀菌分类鉴定标准，对金线莲茎腐病菌从形态学特性和培养特性方面进行研究，结果与Booth′s镰刀菌分类鉴定标准相对照，确定金线莲茎腐病病菌为尖孢镰刀菌。金线莲茎腐病菌菌丝生长和产孢量最适温度均为28 ℃，菌丝生长最适pH为6～7，酸性条件更适宜其产孢，pH为3～5时产孢量最大，其生物学特性与白及根腐病[21]、半夏块茎腐烂病[22]等的病原菌尖孢镰刀菌基本一致。通过对金线莲茎腐病病菌的生物学特性研究，可明确该病菌对生态环境的需求，有利于通过改善栽培基质和环境条件来控制病害的发生。

目前，国内外对金线莲茎腐病的防治较少报道，生产上以化学防治为主， 常用多菌灵、百菌通、代森锰锌和甲基托布津等杀菌剂。本研究证明，戊唑醇乳油对金线莲的茎腐病菌的抑制作用效果较好，其抑制毒力为多菌灵的92.50倍。多菌灵抑制毒力较低可能是由于长期使用多菌灵，病原菌产生了抗药性。戊唑醇是一种高效、广谱、内吸性三唑类低毒杀菌农药，具有保护、治疗、铲除三大功能，杀菌谱广、持效期长。如经田间药效试验得到进一步验证，则可能成为防治金线莲茎腐病的高效首选药剂，在金线莲茎腐病防治中具有较大应用潜力。另外为防止病原菌对该类杀菌剂产生抗药性，在金线莲茎腐病的病害管理体系中应注意与其他杀菌剂合理混合使用或轮换使用，以延缓病原菌抗药性的产生。

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Biological characteristics of Fusarium oxysporum and

inhibitory effects of five fungicides

SHAO Qing-song， LIU Hong-bo， ZHAO Xiao-fang， HU Run-huai， LI Ming-yan

（1.Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture， Zhejiang A & F University， Hangzhou 311300， China；

2. Rare Herbal Medicine and Engineering Institute of Zhejiang Province， Wuyi 321200， China）

[Abstract] The mycelium growth and sporulation in different temperature， pH value and light conditions were detected by using the crossing and haemocytometer method. The toxicity of five fungicides to Fusarium oxysporum was tested by mycelia growth method， so as to provide the reference for prevention and control against F. oxysporum. The optimum temperature and pH value of F. oxysporum to grow and spore were 28 ℃ and 6-7. Alternating light and darkness promoted growth and sporulation of bacterial colony. As for five fungicides， the EC50 of tebuconazole was 10.02 mg·L-1， 92.50 times as much as carbendazim. The EC50 of myclobutanil and Fuxing was 91.23， 96.68 mg·L-1， respectively. Tebuconazole showed the most tremendous inhibitory effect and control efficiency on F.oxysporum.

[Key words] Anoectochilus roxburghii； Fusarium oxysporum； biological characteristic； fungicide； toxicity test

doi：10.4268/cjcmm20140806