新靶点CyclinE干扰RNA对人脑胶质瘤侵袭能力的影响

[摘要] 目的 构建人CyclinE新靶点的干扰RNA真核表达载体，观察cycline表达受抑制后的人脑胶质瘤细胞的侵袭能力的变化。 方法 构建4个新靶点CyclinE干扰rna的真核表达载体后，用双酶切和碱基序列测定，转染载体到胶质瘤U251细胞株，将其分为U251组、PNC-U251组、PCyclinE-1-U251组、PCyclinE-2-U251组、PCyclinE-3-U251组、PCyclinE-4-U251组。通过RT-PCR的结果检测各组CyclinE mRNA的表达量，将干扰效果最好的一组用Transwell小室法检测侵袭能力的变化。 结果 成功构建了新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体即PCyclinE-1、PCyclinE-2、PCyclinE-3、PCyclinE-4，而且CyclinE mRNA表达受到抑制，其中PCyclinE-1-U251组的穿膜细胞数为（45.4±2.7）个，U251组和PNC-U251组的穿膜细胞数分别为（75.2±2.9）个和（74.4±3.5）个，U251组和PNC-U251组的穿膜细胞数比较，差异无统计学意义（t = 1.23，P = 0.31），PCyclinE-1-U251组和U251组的穿膜细胞数比较，差异有统计学意义（t = 15.00，P = 0.00），PCyclinE-1-U251组和PNC-U251组的穿膜细胞数比较，差异有统计学意义（t = 13.81，P = 0.00）。 结论 本实验构建了新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体，PCyclinE-1-U251细胞侵袭能力减弱。

[关键词] 干扰RNA；细胞周期蛋白E；侵袭

[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（b）-0009-04

人脑胶质细胞瘤是人类中枢神经系统中最为常见的肿瘤之一，但是由于其侵袭性能力强，增殖速率快，导致预后极差[1]。尤其是胶质母细胞瘤，恶性程度最高，但是其发病机制目前仍不明确，而且没有像甲胎蛋白、人附睾蛋白、前列腺特异性抗原等常用且有效的肿瘤标志物[2-3]。正常的人脑胶质细胞和胶质瘤细胞的最大区别就在于许多和细胞周期调控的基因发生了改变，细胞周期蛋白E（CyclinE）就是其中之一。CyclinE在人脑胶质瘤中表达，与细胞周期蛋白质依赖激酶2（cyclin-dependent kinase，CDK2）结合促进pRB的磷酸化，并且和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子家族的基因结合在一起形成复合物，促进细胞周期从G1到S进程继续下去。CyclinE过量表达会使G1期缩短，导致细胞进入S期的时间提前，干扰细胞核核酸复制和分裂，导致肿瘤的形成[4-5]。因此，研究CyclinE表达的下调显得非常有意义，每个基因都不是单独存在并且发挥作用的，CyclinE也不例外其表达的下调会影响哪些基因的表达和功能还有待医学工作者去研究。干扰RNA技术能够特异的使基因沉默，近年已经作为一个常规实验应用于肿瘤基因学研究的多个领域。本研究利用RNA干扰技术设计并构建了新的CyclinE干扰RNA真核表达载体，采用双酶切和碱基序列测定的方法鉴定Lipofectamine 2000转染成功构建的4个载体到胶质瘤细胞，通过检测转染后CyclinE mRNA表达量，筛选出沉默效果最好的一个载体，为后续在CyclinE沉默后用双向电泳技术研究蛋白质组学的变化以及用基因芯片技术研究转录水平变化奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人脑胶质瘤U251细胞株购自中科院上海细胞库，DNA内切酶、DNA连接酶购自MBI公司，Lipofectamine 2000转染试剂盒购自上海英骏公司，DNA凝胶回收试剂盒、琼脂糖等购自北京天根生化科技有限公司，Transwell小室购自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

本实验将没有转染质粒的组定为U251组；将转染阴性对照质粒的组设为PNC-U251组；将转染PCyclinE-1质粒的组设为PCyclinE-1-U251组；将转染PCyclinE-2质粒的组设为PCyclinE-2-U251组；将转染PCyclinE-3质粒的组定为PCyclinE-3-U251组；将转染PCyclinE-4质粒的组定为PCyclinE-4-U251组。

1.2.2 新靶点CyclinE干扰RNA的构建

1.2.2.1干扰载体的靶序列 4对siRNA的靶序列即干扰部位为：PCyclinE-1：5'-GGATGGTTCCATTTGCCATGG-3'；PCyclinE-2：5'-GCTTCGGCCTTGTATCAT TTC-3'；PCyclinE-3：5'-GCCAGCCTTGGGACAATAA TG-3'；PCyclinE-4：5'-GCCCTTAAGTGGCGTTTAAG T-3'。同时设立阴性对照（NC）。

1.2.2.2 干扰载体的检验 把所提取的质粒用BamHⅠ，PstⅠ进行双酶切鉴定。正确的重组载体不会被PstⅠ切开但是会被BamHⅠ切开。酶切结果正确的质粒用碱基序列测定方法鉴定载体构建成功与否。

1.2.3 干扰质粒对U251细胞的稳定转染

按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书，把经过鉴定正确的质粒和脂质体混合后分别加入人脑胶质瘤U251细胞中混合培养，48 h后在荧光倒置显微镜下观察实验结果。

1.2.4 RT-PCR检测转染组CyclinE mRNA表达

提取细胞总RNA，进行RT-PCR反应，CyclinE上游引物为5'-ACCAGTTTGCGTATGTGAC-3'，下游引物为5'-CTGCTCTGCTTCTTACCG-3'，扩增产物为583 bp。磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）上游引物为5'-CGGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，下游引物为5'-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'，扩增产物为300 bp。每组设3个平行样本，即每组的PCR产物分别平行的加到3块1.5%琼脂糖胶上分离，用凝胶分析软件分析条带光密度。CyclinE平均光密度值（IDV）与GAPDH的IDV比值（IDVCyclinE/IDVGAPDH）即为CyclinE mRNA的相对表达量，本实验以U251组的CyclinE mRNA的相对表达量为“1”，计算各组的干扰效率=[1-（每组的CyclinE mRNA的相对表达量）/（U251组CyclinE mRNA的相对表达量）]×100%。

1.2.5 Transwell小室法侵袭实验检测细胞的侵袭能力

把Transwell小室按照操作说明书制备好后，细胞计数调整至5×105个/mL。在Transwell小室的上室中加入含2×105个细胞的培养基400 μL，培养箱中放置12 h。吸去上室的液体，再用湿棉签擦去半透膜表面的细胞，常规HE染色或吉姆萨-瑞氏双染。每组设3个平行样本，每张膜计数5个视野，取细胞数的平均值，然后进行统计学分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.1统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酶切和测序结果

双酶切检测和碱基序列测定结果表明，所有的CyclinE真核表达载体以及阴性对照载体均与所设计的序列完全相同，并且没有发现任何异常。见图1。

2.2 CyclinE干扰RNA真核表达载体瞬时转染结果

于转染24 h后，在倒置荧光显微镜下观察各组细胞，除U251组外其他各组均有绿色荧光蛋白表达。

2.3 转染干扰RNA真核表达载体后CyclinE mRNA水平

结果显示，PCyclinE-1-U251组的干扰效率最高，达到77%，因而后续的侵袭实验采用该组作为实验组。见表1、图2。

2.4 转染CyclinE干扰RNA对U251细胞侵移能力的影响

计数每个200倍视野下的12 h穿膜细胞数，PCyclinE-1-U251组的穿膜细胞数为（45.4±2.7）个，U251组和PNC-U251组的穿膜细胞数分别为（75.2±2.9）、（74.4±3.5）个，U251组和PNC-U251组的穿膜细胞数比较，差异无统计学意义（t=1.23，P=0.31），PCyclinE-1-U251组和U251组的穿膜细胞数比较，差异有统计学意义（t=15.00，P=0.00），PCyclinE-1-U251组和PNC-U251组的穿膜细胞数比较，差异有统计学意义（t=13.81，P=0.00）。

3 讨论

RNA干扰的原理是21～25 bp的小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）通过和Dicer酶等复合物的一系列作用使得同源序列mRNA发生降解[6]。干扰RNA技术能够特异的使基因沉默，近年已经作为一个常用的手段应用于研究肿瘤的基因的多个领域：新抗肿瘤药中的研究[7]；肿瘤细胞中基因的改变引起侵袭能力、生长速率、细胞凋亡水平变化、组蛋白甲基化等的研究[8-10]；肿瘤早期发生发展时异常变化[11]相关研究。介导siRNA的载体主要有化学合成的小片段、质粒和慢病毒3种，化学合成的小片段廉价但是转染效率低而且只适合瞬时转染；慢病毒介导载体适合稳定转染，能够使得目的基因整合到基因组中[12]，但是有一定的危险性，不适合一般的实验室使用，所以本研究选用了质粒作为介导的载体，既可以做瞬时转染也适合稳定转染且安全性高。

有研究表明，CyclinE过量表达会使会使得G1期缩短，导致细胞进入S期的时间提前，干扰细胞核核酸的复制和分裂，和骨肉瘤、卵巢癌、鼻咽癌、宫颈癌等肿瘤的侵袭有密切的关系，是导致肿瘤的形成原因之一[13-16]。但是在关于CyclinE在胶质瘤中的表达和作用少有报道。因此本实验就CyclinE在胶质瘤的侵袭中的作用进行了研究，发现当CyclinE扰后，胶质瘤细胞的侵袭能力减弱。

胶质瘤的产生、发展不是某一个基因的作用，如P27蛋白在细胞中可以降解CyclinE-CDK2复合物从而抑制细胞的增殖和分裂[17]。E2F蛋白、锚 蛋 白Ankrd17可以促进CyclinE基因转录和表达[18]。因此CyclinE不是单独存在并且发挥作用的，它表达的下调会影响许多基因的表达和细胞的一系列功能。这些基因有可能在胶质瘤的形成和发展中起非常重要的作用。所以本实验利用RNA干扰技术使得CyclinE沉默，且沉默效果显著，并使得增殖能力和侵袭能力减弱。除去CyclinE在细胞周期中的直接作用外，因为CyclinE和CDK2结合后才能发挥作用，所以当CyclinE沉默后它们的结合复合体减少，可能也引起CDK2的表达减弱，当CDK2表达减弱时也会引起细胞生长速率降低、侵袭能力降低[19]。当然也可能和波形蛋白等许多和肿瘤侵袭、代谢相关的蛋白共同作用的结果。这就需要用双向电泳技术研究蛋白质组学的变化以及用基因芯片技术研究转录水平变化，而本实验为后续的实验奠定了坚实的基础。

综上所述，当本研究干扰RNA的技术使得CyclinE沉默后，再用双向电泳及基因芯片技术来做相应的研究就可能发现一系列有意义的、相关的差异表达的基因和蛋白质，为胶质瘤的研究提供有价值的资料。

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（收稿日期：2014-04-04 本文编辑：任 念）