结核分枝杆菌实验室检测方法的临床研究

摘要：结核分枝杆菌是导致结核病发生的主要致病菌，传染性强，具有较高的发病率和病死率。通常临床诊断结核病时，对诊断方法要求高，需准确、快速、特异性诊断，同时可以准确判断结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。目前结核分支杆菌实验室检测方法日益增多，而其检测结果的敏感性和特异性并没有显著提高。本文就对结核分枝杆菌实验室检测方法进行综述研究，以此寻求简单方便、准确性高、应用广泛的实验室检测方法。

关键词：结核分枝杆菌；实验室检测方法；结核病

结核病是目前世界严重性慢性传染病，在早期WHO就以对结核病发出紧急预告。结核分枝杆菌也可称为结核杆菌，在1882年Koch证明其是结核病病原体[1]。现今诊断技术、治疗方法的改进与发展，相应降低了结核病的死亡率。但随着而来的是结核分枝杆菌耐药菌株的出现，使结核分枝杆菌耐药率不断上升，死亡率不减反增[2]。在治疗和控制结核病时，主要是根据实验室检测方法早期准确对结核分枝杆菌的诊断。现综述如下文。

1细菌学诊断技术

1.1直接厚涂片法 直接厚涂片法操作简单、方便快速，成本低廉，是临床诊断结核病细菌学常用方法。相关资料显示采取直接厚涂片法，其检出率与普通涂片法相比，其高出率高达19%[3]，是《结核病诊断细菌学检验规范》中对结核病诊断的规定方法。

1.2集菌涂片法 集菌涂片法利用检测标本体积或离心、浮游等方法，使标本中结核杆菌富集，操作复杂，应用少。

涂片法的应用，成本低廉，操作简单，但敏感性约为37%，较低，特异性为94%[4]，无法有效准确区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。

1.3 BACTEC-TB-460快速检测系统 BACTEC-TB-460快速检测系统可对结核分枝杆菌代谢产物进行有效测定，于米氏7H12培养基中添加放射性14C量，阳性则为生长指数GI值超过19[5]。此种方法初代分离率较高，报告时间短，2d内可检出阳性标本，而改良罗氏法最快需要约20d才可检测出阳性结果，阴性检测需2个月报告，而BACTEC-TB-460快速检测系统只需1个月[6]。该法可分离分枝杆菌，在分枝杆菌药敏试验和菌型鉴定中得到广泛应用。但该法污染率高，微量放射线，会污染环境，且操作技术水平要求高，价格高。

1.4变色液体培养基培养法 结核分枝杆菌在实施培养基中发现，含有多种维生素、抗生素、谷氨酸钠、变色剂、马血清等营养丰富的选择性培养基。其培养基营养丰富，其检测率高。相关学者[7]报道，痰标本阳性检测时间约7d，发生率52%，污染率2.8%。在改良罗氏法检测中检出时间约20d，阳性率38%，污染率2.1%。

1.5 BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪 BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪在检测结核分枝杆菌时，通过在MGTI培养管中置入检测标本，管中营养成分和氧气会被生长的分枝杆菌吸收，通过MGTI培养管中的氧气浓度变化会相应改变荧光显示剂。当氧气消耗时会促使管内荧光指示剂释放荧光。培养仪报警，阳性指示器红色，且液晶显示屏会显示检测结果阳性位置，此种方法可有效判断分枝杆菌，并进行细菌的药敏试验。

1.6噬菌体生物扩增法 噬菌体生物扩增法是在1997年所发现的快速检测结核分枝杆菌的新型技术[8]。噬菌体生物扩增法的应用，在噬菌体能感染、裂解结核分枝杆菌等基础上，对检测标本中MTB利用特异性MTB噬菌体快速使其感染和裂解；未感染MTB的噬菌体经杀病毒剂有效清除，继续大量复制，以此裂解MTB，释放子代噬菌体。子代噬菌体感染可生成敏感细胞，在琼脂平板上肉眼可见敏感细胞菌苔的噬菌斑[9]。噬菌斑数量越多，结核分枝杆菌的数量也越多。

2免疫学诊断技术

2.1结核抗体检测 酶联免疫吸附试验（ELISA）是至今诊断结核诊断常用方法，通过ELISA法可有效检测患者血清中结核特异性抗体。斑点免疫层析试验操作简单、方便快速优于ELISA，可单人份测定。免疫印迹试验特异性和敏感性较高，结合凝胶电泳与酶联免疫技术[10]，可有效检测血清结核抗体对活动性结核病，但操作较复杂，临床应用少。

2.2结核抗原检测 结核抗原是机体感染结核杆菌后常见物质，通过检测结核抗原，可直接判断结核杆菌的存在，降低患者因免疫应答较低致假阴性的出现，该法通过对结核病患者血清结核抗原进行检测，以此判断。在相关学者[11]报道中，采取结核抗原检测方法检测，其检测敏感性高达84.17，特异性高达92.19%，可见，结核抗原检测方法存在较高的敏感性及较强的特异性。

2.3细胞因子检测 结核病患者在MT抗原激活下，血液或局部中T淋巴细胞、巨噬细胞或单核细胞会释放白细胞介素2受体、R干扰素、膜IL-2受体及A肿瘤坏死因子[12]，通过检测机体细胞因子，利用EILAS检测方法，对患者血清、胸腔积液、脑脊液中细胞因子，可作为诊断结核病的辅助方法。

3分子生物学诊断技术

3.1定量PCT技术 此种方法在扩增时添加特异性荧光探针及引物，在定量PCT技术中，相应增加对引物及特异性荧光探针，通过根据荧光信号变化，以此对PCR整个过程进行实施实时监测，以标准曲线定量分析未知模板[13]，定量PCT技术较常规PCR相比，其具有更高的灵敏度，及更高的特异性，优于常规PCR。且常规PCR会带来一定污染，而采取定量PCT技术，避免常规PCR所带来的污染性，具有较高的自动化程度。

3.2分枝杆菌分子菌种鉴定 在鉴定分枝杆菌分子菌种时，其鉴定方法包括：PCR菌种鉴定、PCR直接测序鉴定、PCR限制性片段长度多肽性鉴定法、PCR-DNA探针鉴定法、PCR-基因芯片鉴定等方法[14]。PCR菌种鉴定、PCR直接测序鉴定、PCR限制性片段长度多肽性鉴定法、PCR-DNA探针鉴定法只能够对部分菌种进行鉴定，PCR-基因芯片鉴定方法利用杂交测序对分枝杆菌菌种进行鉴定[15]，操作简单快速。

3.3分子药敏试验 在对结核分枝杆菌耐药基因突变进行检测时，通过采取多种基因突变技术可有效检测，一般分子机制可导致MT耐药，通常在检测时利用各种基因突变分析技术，可检测出一定的耐药性MT，但通常实际临床检测中依然存在耐药分子机制。据相关资料显示，多种基因突变技术检测结核分枝杆菌耐药基因突变时，未有效检测出高达40%耐药分离株[16]，未能检测出耐药基因突变。

4总结

在临床实验室检测结核分枝杆菌时，常用方法涂片法、培养法、PCR法等，各种方法具有各自优势，其检测的灵敏度、特异性也各不相同。应掌握各种检测方法的优势和缺点，选择准确有效的诊断方法，明确结核分枝杆菌的特点，与其他病菌之间的关系，以此有效检测、诊断和鉴别结核分枝杆菌，为临床对结核病的早期治疗和控制提供必要的参考依据。

通常结核分枝杆菌生长速度缓慢，一般在分裂时，其间隔时间是在18h，因此在培养结核分枝杆菌时，需耗费较长的时间。为了提高临床诊断确诊率，需要有效统计分析我国体检人员结核分枝杆菌的各项数据，使相关人员能够初步了解和基本掌握结核分枝杆菌的阳性检出率及相关的药敏耐药率，同时检测人员必须要认识到结核分枝杆菌检测各项技术的优劣性，选择最佳检测技术，必要时可联合各项技术，以此提高结核分枝杆菌检出率，准确判断结核分枝杆菌，为临床治疗和诊断提供科学合理的参考依据。

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