四君子汤对骨骼肌萎缩的影响

癌性恶病质( Cancer cachexia，CC) 是恶性肿瘤病人常见的一种临床综合征，是进展期恶性肿瘤最普遍的临床表现，临终前的恶性肿瘤患者几乎都有恶病质表现，占肿瘤患者死亡原因的 22%［1］。由于肿瘤诱导的骨骼肌蛋白的大量降解，导致骨骼肌的萎缩，致使病人出现疲劳、活动能力下降等症状，它降低了患者对治疗的耐受性，严重影响了患者的生活质量和生存时间。许多炎症细胞因子参与了恶病质的形成。本研究以健脾益气的四君子汤为干预措施，利用 lewis 肺癌恶病质小鼠模型，观察四君子汤对骨骼肌萎缩以及 TNF － α、IL － 6 表达水平的影响。

1 材料和方法

1. 1 实验动物 清洁级 C57B1 /6 雌性健康小鼠 60只，6 ～8 周龄，体重 19 ～22g，由中国科学院动物中心( 上海) 提供。

1. 2 细胞株及接种方法 Lewis 肺癌细胞株购买自中科院上海分院药物研究所。培养液( 10% 小牛血清、100U / mL 青霉素、100μg / mL 链霉素组成) 中培养，每3 ～ 4 天传代一次，胰蛋白酶收获细胞，PBS 冲洗，制成每毫升 PBS 含5 ×105个细胞的混悬液。将5 ×105( 溶解于 0. 1mL PBS) 个细胞接种于小鼠背部皮下两肩胛骨之间［2］。

1. 3 药物 四君子汤组方为: 党参、白术、茯苓、甘草，以 9∶ 9∶ 9∶ 6 配比，药材由上海市普陀区中心医院中药房提供。煎汤取汁。

1. 4 分组及给药方法 将 60 只小鼠随机分为 6 组，荷瘤中药长期大剂量组( A 组) ，荷瘤中药短期大剂量组( B 组) ，荷瘤中药长期小剂量组( C 组) ，荷瘤中药短期小剂量组( D 组) ，荷瘤空白组( E 组) ，生理盐水对照组( F 组) 。每组 10 只。A、B、C、D 组给以灌服四君子汤，大剂量组( A、B 组) 设计相当于生药每日 0. 66克( 四味中药总量) 煎汤灌服，小剂量组( C、D 组) 设计为大剂量的一半。长期给药组( A、C 组) 从实验第二天开始给药，短期给药从实验第 8 天开始给药，E 组不给任何干预，F 组从实验第二天开始给以灌服生理盐水。

1. 5 取材及石蜡切片 至第 17 天实验结束，于眼球后静脉取血，离心后取血清。处死动物，摘取瘤体称重，摘取双侧腓肠肌称重。取一侧腓肠肌以多聚甲醛固定，于液氮中冻存备用。

1. 6 观察指标及检测方法 采用 ELISA 方法检测血清肿瘤坏死因子 － α( TNF － α) 、白细胞介素 －6( IL －6) 的表达水平。试剂盒购自上海华雅思创生物科技有限公司。

1. 7 统计学方法 各组数据均以均数 ± 标准差表示，组间比较采用 S － N － K 检验，所有数据均用 SPSS17. 0 统计软件进行分析。

2 结 果

2. 1 各组骨骼肌病理学形态 见图 1。

2. 2 各组小鼠双侧腓肠肌重量( 表 1 ～ 3) 与生理盐水组相比，荷瘤组各组骨骼肌重量存在不同程度的下降( 表 1) ，其中荷瘤空白组与生理盐水组相比，差异在统计学上有显著性意义( P ＜ 0. 05) ，长期大剂量组的双侧腓肠肌重量及双侧腓肠肌重量/去瘤体重比值接近于生理盐水组( P ＞0. 05) 。荷瘤中药组的双侧腓肠肌重量明显高于荷瘤空白组( 表 2) ，差异在统计学上有显著性意义( P ＜0. 05) 。荷瘤长期给药组的双侧腓肠肌重量明显高于荷瘤短期给药组( 表 3) ，差异在统计学上有显著性意义( P ＜0. 05) 。

2. 3 血清细胞因子变化( 表 4) 与生理盐水组相比，荷瘤组各组存在着血清 TNF － α、IL － 6 的高表达( 表4) ，其中荷瘤空白组与生理盐水组相比，差异在统计学上有显著性意义( P ＜0. 01) ，长期给药组 TNF － α、IL － 6 表达水平与荷瘤空白组相比，差异在统计学上有显著性意义( P ＜0. 05、P ＜0. 01) 。

3 讨 论

骨骼肌萎缩是癌症恶病质最主要的特征之一［3］。本研究显示，在 Lewis 肺癌小鼠模型中存在着明显的骨骼肌萎缩现象，具体表现为荷瘤鼠双侧腓肠肌重量的明显下降，骨骼肌病理组织切片也观察到荷瘤各组存在不同程度的肌肉萎缩。引起骨骼肌萎缩的确切机制不详，其原因涉及到关于代谢的多个分子和细胞内的调节机制，但最终的蛋白合成减少和蛋白质降解增加是造成骨骼肌代谢异常的主要原因，而其中蛋白降解增加，尤其是肌原纤维中肌动蛋白和肌球蛋白的降解增加是导致肌肉萎缩，并发生肌肉恶病质最重要的原因。目前研究认为在肌肉恶病质进展过程中，多种炎症细胞因子参与其调控机制。有研究认为，静脉给予正常大鼠 TNF － α 和干扰素 － γ 或白细胞介素 － 1( IL － 1) ，会导致骨骼肌泛素基因表达的增加［4］。给恶病质动物应用多种细胞因子抗体后，可以减少骨骼肌蛋白的丢失［5］。Llovera等［6］的研究发现，种植了 Lewis 肺癌的大鼠外周循环中 TNF － α 水平升高与肌肉蛋白降解增加有关 Fujita等［7］对结肠 －26 腺癌细胞接种的小鼠研究发现，在肿瘤接种后 17 天，腓肠肌的重量下降到正常对照组的69% ，给予抗鼠 IL － 6 受体抗体后，腓肠肌重量增加到正常的 84%。本研究结果发现，在 Lewis 肺癌恶病质小鼠中，荷瘤鼠的血清 TNF － α 和 IL － 6 水平均明显高于生理盐水组( P ＜0. 05) ，药物干预后，二者水平均有不同程度的下降。治疗方面，目前普遍认为孕激素类药物甲羟孕酮等能够通过增进食欲，使癌症恶病质得到改善，但总体的生存质量并未同时获得提高，而且水纳潴留及血栓形成的副作用明显增加［8］。静脉高营养的使用未能延长恶病质患者的生存期，以营养支持提供肿瘤患者营养物质和热能的治疗方法收效甚微。祖国医学之“萎证”以肌肉的萎软不用为主要特征，肿瘤恶病质患者由于骨骼肌萎缩引起的功能活动的下降与“萎证”有相似之处，根据“治萎独取阳明”的治疗理念，本课题选择益气健脾的四君子汤作为干预措施进行研究，结果显示，治疗组能不同程度地延缓肺癌恶病质小鼠骨骼肌萎缩的进展，其中以长期大剂量给药组效果最佳，体现了中药早期、全程干预恶性肿瘤的治疗优势。同时，治疗组能不同程度地降低炎症细胞因子 TNF － α和 IL －6 的水平，提示这可能是四君子汤治疗肺癌恶病质骨骼肌萎缩的作用机制之一。