厚朴四君子汤颗粒剂中有效成份提取物的高效液相色谱指纹图谱研究

广东省深圳市南山区西丽人民医院药剂科，广东深圳 518055

[摘要] 目的 建立厚朴四君子汤颗粒剂中有效成份提取物指纹图谱标准及指纹对照品，为厚朴四君子汤颗粒剂指纹图谱的检测提供依据。 方法 采用HPLC法建立提取物、颗粒剂指纹图谱，SHISEIDO CAPCELL PAK C18MGⅡ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-0.05%三氟乙酸水梯度洗脱，体积流量1.0 mL/min，检测波长230 nm。 结果 建立的各HPLC指纹图谱测定条件分离良好，以指纹对照品为参比，测得厚朴四君子汤颗粒与提取物的相似度一致性良好。 结论 所建立的HPLC指纹图谱方法重复性好，可为厚朴四君子汤提取物、颗粒剂的质量控制提供依据。

[关键词] 栀子厚朴汤颗粒；提取物；指纹图谱；高效液相色谱；相关性

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）03（c）-0138-04

Study on fingerprint of effective components of Magnolia officinalis with high performance liquid extract of Magnolia Officinalis Cortex Four Gentlemen Decoction Granules in chromatography

ZENG Qingguo YANG Xiaoqiu

Department of Pharmacy， Xili People's Hospital of Nanshan District in Shenzhen City， Guangdong Province， Shenzhen 518055， China

[Abstract] Objective To establish the Magnolia Officinalis Cortex Four Gentlemen Decoction Granules of effective components in the extract of the standard fingerprint and the fingerprint reference substance， provide the basis for the testing standard of Magnolia Four Gentlemen Decoction granules fingerprint. Methods The fingerprint of extract， granule by HPLC method was established， with SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MG column （4.6 mm × 250 mm， 5 μ m）， Acetonitrile-0.05% three trifluoroacetic acid water gradient， volume flow rate was 1.0 mL/min， the detection wavelength was 230 nm. Results The HPLC fingerprint determination was good， to the fingerprint reference material， similarity measured Magnolia Officinalis Cortex Four Decoction Granule and Extract of four noble particles and extract had good consistency. Conclusion The method of HPLC the fingerprint repeatability， provides the basis for the quality of Magnolia Officinalis Cortex Four Gentlemen Decoction Extract， Granule control.

[Key words] Magnolia Officinalis Cortex Magnolia Decoction Granules； Extract chromatography； Fingerprint； HPLC； Correlation

自拟厚朴四君子汤颗粒由厚朴、党参、丹参、黄芪、白芍、白术、炙甘草、茯苓、生姜、大枣等中药组成。其中方中厚朴中主要成分厚朴酚与和厚朴酚，党参中主要成分党参正丁醇，丹参中主要成分有丹参素、原儿茶醛等。厚朴四君子汤颗粒抑制胃肠平滑肌运动，抗菌消炎、保护胃黏膜、增强机体免疫能力、活血化瘀，能改善局部胃黏膜的微循环，抑制炎性反应，促进组织修复和再生，有利于溃疡愈合。为了掌握厚朴四君子汤颗粒中有效成分的质量，本研究采用高效液相色谱法对厚朴四君子汤颗粒剂的提取物及颗粒进行指纹图谱研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Shimadzu 2010高效液相色谱系统（日本岛津公司），Agilent HP1100 LC—DAD色谱系统（安捷伦科技公司），Thermo Finnigan Surveyor LC—TSQ Quanturn Ulna AM液相色谱串联质谱系统（美国菲尼根 质谱公司）。中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版，国家药典委员会；MET TLER TOLEDO AL204电子天平。

1.2 试剂

自拟厚朴四君子汤颗粒，丹参素钠对照品（编号110855-200203），原儿茶醛对照品（编号110810-200205）（中国药品生物制品检定所）；甲醇（色谱纯）、醋酸为分析纯（上海化学试剂有限公司），对羟基苯甲酸为南京化学试剂厂AR试剂，乙腈为色谱纯（美国天地公司）；纯净水自制（过0.45 μm滤膜）。芸香柚皮苷（批号MusT.11 101011）；厚朴酚、和厚朴酚、党参正丁醇、丹参素、原儿茶醛等均来源于中国食品药品检定研究院，供含量测定用[1-2]。

1.3 色谱条件的确定[3]

色谱条件与系统适用性试验Waters Acquity UPLCTM HSS T3 色谱柱（250 mm×4.6 mm，10 μm）。以含0.02% mL/mL磷酸的80%乙腈为流动相A；以0.02% mL/mL的磷酸水溶液为流动相B，按流动相梯度洗脱表进行洗脱；流速为每分钟0.4 mL；检测波长为280 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温为室温；进样量20 μL；检测时间为140 min。见表1。

表1 流动相梯度洗脱参照

2 方法

2.1 内标溶液的制备

精密称取对羟基苯甲酸10.0 mg置于100 mL量瓶中，加1%醋酸溶液稀释至刻度，作为内标溶液。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取厚朴酚、和厚朴酚、党参正丁醇、丹参素、原儿茶醛等对照品各4.0 mg，置于200 mL量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度（每1 mL含40、24、30、320、320、30 μg），作为对照品储备液。

2.3 标准溶液的制备

精密量取上述对照品储备液1.0，2.0，3.0，4.0， 6.0，8.0 mL置于10 mL量瓶中，各精密加入内标溶液1.0 mL，用1%醋酸溶液稀释至刻度，作为绘制标准曲线的系列浓度标准溶液。

2.4 供试品溶液的制备[4]

取厚朴、党参、丹参等粉末各0.35 g，另取厚朴四君子汤颗粒提取物粉末0.2 g，厚朴四君子汤颗粒0.28 g，药粉末均过60目筛，精密称取，将供试品置于25 mL量瓶中，加入内标溶液20 mL，加入1%醋酸溶液超声处理30 min，使其溶解，放至室温并用1%醋酸溶液稀释至刻度，样品溶液用0.45 μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。（注：“精密称取”系指称取重量应准确至所取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。）

3 结果

3.1 精密度试验[5]

分别5种供试品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积，各重复进样6次，测得厚朴、党参、丹参、厚朴四君子汤颗粒提取物及厚朴四君子汤颗粒等HPLC色谱图，以芸香柚皮苷为参照峰，选择17个主要共有峰进行考察，峰面积的RSD为≤2.73%，相对保留时间RSD≤0.2%，采用国家药品监督管理局推荐的“计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件”（中南大学设计），结果表明仪器精密度良好。

3.2 线性关系的测定[6]

精密量取同一批样品6份供试品溶液，置入5 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，吸取10 μL，注入液相色谱仪，进行依法进样分析，记录色谱图，以供试品峰面积积分值为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归。对17个色谱图中的色谱峰进行考察，结果显示色谱峰相对保留时间的RSD≤0.20%，色谱峰相对峰面积的RSD≤2.78%。结果显示该方法重复性良好。

3.3 稳定性实验

精密称取厚朴四君子汤颗粒供试品，置入25 mL量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，吸取续滤液10 μL，分别于0，2，8，12，16，24 h注入液相色谱仪，记录17个色谱图中的色谱峰峰面积积分值进行考察，结果显示色谱峰相对保留时间的RSD≤0.20%，色谱峰相对峰面积的RSD≤2.43%。结果显示本品含量测定溶液在24 h内稳定性良好。

3.4 样品检测

分别各药材供试品溶液、对照品溶液、提取物供试品溶液及颗粒剂供试品溶液样品，按供试品溶液的制备方法操作，测定。记录HPLC色谱图。

3.5 指纹图谱建立与分析

对10个厚朴四君子汤颗粒提取物样品及10批颗粒剂的色谱数据导出。时间窗为0.10，平均数法生成对照图谱。色谱图按6个点进行校正。生成的对照图谱见图1，厚朴四君子汤颗粒物与提取物的指纹图谱见图2，厚朴四君子汤颗粒色谱峰与药材的相关性见图3～6。

时间（min）

图1 厚朴四君子汤颗粒HPLC对照指纹图谱

4 讨论

中药指纹图谱强调“整体性”和“指纹性”。由于中药成分复杂，指纹图谱研究的研究影响因素众多，包括提取方法、色谱柱、检测波长、流动相、相似度评价手段等的影响[7-9]。做指纹图谱的目的就是对含有有效成分的部位或整体进行总的质和量的控制。根据色谱条件和研究目的的不同，同一个中药材，可以做出多张指纹图谱[10]。对药材的质和量的控制标准，在指纹图谱的建立过程中要有三维的立体图谱，最后定出的最佳图谱不一定要求每个峰达到最大峰高和最高含量，但要综合考虑指纹图谱中每个成分的峰形，确定药材的指纹图谱[11-13]。在条件相同的情况下和液相精密度准确的情况下，可以通过测定药品成分的含量，达到全面控制中药质量的目的[14-15]。中药指纹图谱要较全面、客观地反映药材质量，尽可能地在一张色谱图上通过多成分定性和定量测定来反映药材质量。选择测定波长也是很重要的一步。在此波长下应使尽可能多的药物成分都有吸收，这样在色谱图上才能体现出质量成分的色谱峰[16]。指纹图谱中定量的统一很难做到，对于不同地区的药材只能用主要的有效成分定性的去确定它[17]。虽然是同一品种的药材，不同的地区或不同的时期采样的样品含有有效成分的量是不同的。本研究中建立厚朴四君子汤颗粒剂中有效成份提取物指纹图谱标准及指纹对照品，采用HPLC法建立提取物、颗粒剂指纹图谱，结果显示建立的各HPLC指纹图谱测定条件分离良好，以指纹对照品为参比，测得厚朴四君子汤颗粒与提取物的相似度一致性良好。提示所建立的HPLC指纹图谱方法重复性好，为厚朴四君子汤提取物、颗粒剂的质量控制提供依据。HPLC其灵敏度更高，理论塔板数高，分离效果好，出峰时间短，同时可以减少有毒溶剂的使用量，更有利于环保[18]。选择HPLC技术开发指纹图谱与含量测定的条件，能更简便、快速及准确的控制产品的质量。

[参考文献]

[1] 陈新民.中药指纹图谱技术的发展现状及应用[J].中药研究与信息，2004，6（3）：37.

[2] 吕春平，关铭.中药指纹图谱的应用[J].天津药学，2004，16（2）：58.

[3] 王丽霞，万素君.指纹图谱在中药研究中的应用[J].中国中医药，2003，（8）：35.

[4] 陈玉秀.HPLC测定整肠正气丸中和厚朴酚及厚朴酚的含量[J].中国现代中药，2013，15（5）：410-412.

[5] 贾萍.指纹图谱与中药质量控制[J].中国药业，2004，13（2）：79.

[6] 冯慧萍，杨中林，胡育筑.厚朴及其炮制品HPLC-DAD-MS色谱指纹图谱的研究[J].中成药，2007，29（1）：84.

[7] 冯华，聂明华，罗秀琼，等.高效液相色谱法测定半夏厚朴汤不同煎液中和厚朴酚含量[J].中国药业，2012，21（4）：21-22.

[8] 许景景，吴纤愫.高效液相色谱法测定吐泻肚痛胶囊中厚朴酚与和厚朴酚含量[J].中国药业，2010，19（20）：36-38.

[9] 魏清芳，王嘉林.木香顺气丸甲醇提取物的HPLC指纹图谱[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（8）：110-115.

[10] 李晓琳，邵爱娟，陈敏，等.道地产区不同产地厚朴种子的电泳指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2011，36（22）：3075-3078.

[11] 秦郁文.高效液相色谱法测定香砂养胃软胶囊中厚朴酚与和厚朴酚含量[J].中国药业，2013，22（17）：36-37.

[12] 张海江，郭怀忠，杨晓萍，等.固相萃取-高效液相色谱法测定藿香正气口服液中厚朴酚与和厚朴酚的含量[J].药物分析杂志，2009，29（2）：316.

[13] 苏伟.高效液相色谱法测定半夏厚朴汤不同煎液中和厚朴酚含量[J].中国保健营养，2013，23（3）：1460-1460.

[14] 孙艳清，马冯飞，朱杰，等.栀子厚朴汤及相关药对和单味药材的指纹图谱研究及多指标定量分析[J].药学进展，2011，35（8）：373-378.

[15] Zhu L，Feng F，Ye XM，et al. LC chamcterization of the major constituents in Zhi Zi Hou Pu decoction using various detection appmaches [J]. Chromatographia，2009，70（5/6）：975-980.

[16] 黄春跃，杨义芳，唐博雅，等.栀子厚朴汤颗粒指纹图谱与组方药材及其提取物的相关性研究[J].中成药，2013，35（8）：1720-1723.

[17] 张怡辰.厚朴药材中厚朴酚与和厚朴酚的含量测定及化学模式识别[J].亚太传统医药，2012，8（3）：20-21.

[18] 张赫名.HPLC法测定香砂养胃丸（浓缩丸）中厚朴酚、和厚朴酚的含量[J].医药前沿，2013，（2）：295-296.

（收稿日期：2013-12-08 本文编辑：卫 轲）