有光学活性藻蓝蛋白的异源重组表达条件优化

【前言】有光学活性藻蓝蛋白的异源重组表达条件优化由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。引言 节旋藻（Arthrospira）是一种丝状蓝藻，藻蓝蛋白是其吸收和传递光能的色素蛋白，它不仅具有抗氧化，抗肿瘤等作用[1-4]，还是一种天然色素，可以作为食品添加剂广泛用于医药、食品、化妆等行业[5]，具有很高的应用价值。 利用异源系统合成有光学活性的藻蓝蛋白，...

[摘 要]为了优化重组表达藻蓝蛋白的表达水平和光学活性，本文将Arthrospira platensis FACHB314中合成有光学活性的藻蓝蛋白相关基因ussBcpcBA，hox1，pcyA，cpcE，cpcF共转化大肠杆菌，进行了藻蓝蛋白的异源重组表达，通过三因素三水平的正交实验得出菌体的最佳诱导表达条件为37℃，0.1mmol/L的IPTG诱导表达2小时。研究了不同处理条件对重组表达菌体低温荧光的影响，优化了处理菌体沉淀的溶液为pH 7.0，0.01mol/L的PBS溶液。本研究为有光学活性藻蓝蛋白的异源表达、检测和应用奠定了基础。

[关键词]荧光活性；藻蓝蛋白；重组表达，诱导

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）11-0351-04

Optimization of the inducementand treatment conditions forthe recombinant expression of opticalPhycocyaninin Escherichia coli

FENG Xiaoting， Wu Fei， Huang Xiaoyun， JIN Yuming， XIAO Dongfang， ZANG Xiaonan*， ZHANG Xuecheng

引言

节旋藻（Arthrospira）是一种丝状蓝藻，藻蓝蛋白是其吸收和传递光能的色素蛋白，它不仅具有抗氧化，抗肿瘤等作用[1-4]，还是一种天然色素，可以作为食品添加剂广泛用于医药、食品、化妆等行业[5]，具有很高的应用价值。

利用异源系统合成有光学活性的藻蓝蛋白，不仅可以获得大量的藻蓝蛋白，而且便于对其进行修饰和改造，以及用于光合系统重建，满足人们多方面的需求。Tooley[6]等首次实现了在大肠杆菌中合成荧光活性藻蓝蛋白。关翔宇等[7]用一个表达载体完成荧光活性藻蓝蛋白的体外合成。本实验室衣俊杰等[8]进行了光学活性藻蓝蛋白组合生物合成，发现含有藻蓝蛋白亚基基因ussBcpcBA，色基裂合酶基因cpcE，cpcF，以及催化合成藻蓝胆素的hox1，pcyA基因组合表达时荧光效果最好。随着研究的不断深入，重组表达藻蓝蛋白的光学特性以及催化合成有光学活性藻蓝蛋白的元件的功能等成为人们研究的重点。此外人们对于有光学活性藻蓝蛋白的需求日益增加，迫切要求优化藻蓝蛋白的重组表达条件和检测方法。

外源蛋白在大肠杆菌中诱导表达受到许多条件的影响，如宿主菌的选择，密码子的偏爱性，温度，时间，诱导剂IPTG的浓度等因素[9]。本实验中表达有光学活性的藻蓝蛋白，涉及到5个基因――ussBcpcBA，hox1，pcyA，cpcE，cpcF，分别构建在两个相容质粒pET24a和pACYC- Duet中，其中hox1、pcyA基因翻译合成的亚铁血红素氧化酶和铁氧蛋白氧化还原酶催化合成藻蓝胆素，构建在表达载体pET24a中；ussBcpcBA是藻蓝蛋白β亚基和α亚基基因，cpcE和cpcF翻译表达色基裂合酶，可催化藻蓝蛋白与藻蓝胆素结合，ussBcpcBA和cpcE-cpcF分别构建在表达载体pACYC- Duet的两个表达框中。为保证各基因之间协调表达，获得最优的光学活性，本研究在前期实验基础上，选取温度，时间，诱导剂IPTG的浓度进行了三因子三水平的正交实验设计，通过检测单位质量藻蓝蛋白的低温荧光发射光谱以确定最优的诱导表达条件。另外，由于蛋白的稳定性受处理溶液的影响[10-11]，本实验进一步检测了不同溶液，不同pH和浓度的PBS重悬表达有荧光活性藻蓝蛋白的菌体沉淀对低温荧光发射光谱的影响，以便得到稳定的荧光检测结果。本研究为重组表达和检测有光学活性藻蓝蛋白提供实验基础。

1 材料

表达菌株E.coli/uBAEF（314）由本实验室构建，含有表达载体pET-24a（+）-hox1-pcyA及pACYC-ussBcpcBA-cpcE/F。

2 方法

2.1 重组菌诱导表达条件的研究

单因子预实验发现温度在20-37℃，IPTG浓度在0.1-10mmol/L，诱导时间在2-10h都能使重组菌表达有光学活性的藻蓝蛋白，因此，设计了三因素三水平的正交实验确定最优的诱导表达条件，如表1。

2.2 重组表达菌的低温荧光检测

对菌体进行低温（液氮温度）荧光光谱检测，扫描速度1200nm/min，狭缝宽度5.0nm，电压为950V，用590nm激发波长对处理样品进行荧光激发。

2.3 重组表达菌的SDS-PAGE及western blot检测

重组菌进行藻蓝蛋白的SDS-PAGE，配制的浓缩胶为5%，分离胶为12%。然后进行western blot检测，以兔抗藻蓝蛋白多克隆抗体为一抗，以羊抗兔IgG为二抗。

2.4 重组菌藻蓝蛋白的定量

将SDS-PAGE的结果用软件Launch sensiAnsys.exe进行定量分析。计算藻蓝蛋白在总蛋白中的百分比。重组藻蓝蛋白表达量=总蛋白浓度？藻蓝蛋白在总蛋白中的百分比。

2.5 菌体的不同处理条件对低温荧光的影响

以E.coli/uBAEF（314）为表达菌株，诱导表达后用溶剂（表2）取1ml对50ml菌体沉淀进行悬浮相当于对菌液进行1：50的浓缩处理，三个平行样。

3 结果与分析

3.1 重组菌诱导表达条件的正交实验

3.1.1重组菌的SDS-PAGE与western blotting分析

将诱导表达的重组菌进行了SDS-PAGE和western blotting，结果如图1所示。在18KD附近出现不同于空白对照的蛋白条带，经过western blotting检测，在18KD出现藻蓝蛋白的杂交条带，表明重组菌可有效表达藻蓝蛋白。

3.1.2重组藻蓝蛋白定量分析

将正交实验设计的9组重组菌进行SDS-PAGE检测，均在18kD出现的不同于空白对照的蛋白条带（图2），表明不同诱导条件下重组菌均可有效表达藻蓝蛋白。

将与蛋白电泳同样浓度的菌体进行超声波破碎后取上清进行总蛋白浓度测定，蛋白提取效果良好。通过软件Launch sensiAnsys.exe对SDS-PAGE中藻蓝蛋白进行了定量分析，求得了重组菌总蛋白含量及重组菌藻蓝蛋白的表达量如表3所示。

3.1.3 重组表达菌的低温荧光检测

将重组表达菌用FL-4600荧光光谱仪测得的荧光谱结果如图3所示，结果初步表明37℃时重组菌的荧光强度明显优于其他温度，其中在IPTG浓度为0.1mmol/L，诱导2小时，荧光强度最强，藻蓝蛋白发射峰的位置处于635nm左右。28℃时，荧光强度仅次于37℃，20℃时重组菌的荧光强度最弱。

根据重组菌藻蓝蛋白的发射光谱，以荧光发射峰值和藻蓝蛋白的表达量（表3）计算单位质量藻蓝蛋白（635nm）荧光强度（表4），然后对正交实验结果进行分析，结果显示各因素影响指标的主次顺序为：A（温度）>C（时间）>B（IPTG）。温度对重组菌表达影响最大，37℃是最优温度。从时间上分析，2小时表达最优。IPTG的浓度为0.1mmol/L表达良好，因此，根据峰值分析确定最佳诱导表达条件为A3B2C1，即37℃，0.1mmol/L IPTG，2小时。

3.2 菌体的不同处理条件对低温荧光的影响

3.2.1不同溶剂处理对重组表达菌株低温荧光的影响

分别用三蒸水，生理盐水（0.9%的NaCl溶液），LB液体培养基，0.1mol/L PBS做溶剂重悬50ml菌体沉淀，测低温荧光光谱，重复三次，取平均值，并以656nm处的最低荧光值为基础去本底荧光，如图4。发现0.1mol/L的PBS溶液重悬菌体沉淀时荧光强度远远高于其余溶液，峰值在630nm，与天然藻蓝蛋白的荧光发射峰（635nm）的位置基本一致。用生理盐水和三蒸水处理时，两者荧光强度相当，只是峰值一个处于630nm，另一个在635nm。LB培养基重悬沉淀时，荧光强度低于0.1 mol/L PBS，高于生理盐水和三蒸水，峰值在635nm。因此，我们选择PBS作为处理重组表达菌体的溶液。

3.2.2不同浓度的PBS溶液处理对重组表达菌株低温荧光的影响

收集50ml菌体沉淀，分别用1ml 0.01mol/L，0.1mol/L，0.2mol/LPBS溶液（pH 7.0）悬浮，测定低温荧光，重复三次，取平均值，并以658nm处的最低荧光值为基础去本底荧光，如图5所示。结果表明0.01mol/L，0.1mol/L和0.2mol/L PBS溶液处理菌体的荧光发射峰的峰值都在630nm处。用0.1mol/L和0.01mol/L的PBS处理菌体时，相对荧光强度最大，分别为81.14和76.27，二者差异不显著，但显著高于0.2mol/L 的PBS处理菌体时荧光强度（57.54）。我们选择0.01mol/L作为处理重组表达菌体的PBS浓度。

3.2.3不同pH的PBS溶液处理对重组表达菌株低温荧光的影响

用pH为6.0，7.0，8.0的PBS溶液（0.01mol/L）重悬50ml的菌体沉淀，测定低温荧光光谱，重复三次，取平均值，并以656nm处的最低荧光值为基础去本底荧光。如图6。pH为7.0时，荧光强度最大，pH为8.0时荧光强度最小，pH为6.0时处于前两者之间。但是，从总体来讲，三者重悬菌体的荧光强度差异不显著，荧光发射峰峰值均位于630nm处。最终我们选择pH7.0作为处理重组表达菌体的PBS的pH值。

4 讨论

在大肠杆菌中表达藻蓝蛋白使用了两种表达载体，分别是双克隆载体pACYCDuet-1（抗氯霉素）和pET-24a（+）（抗硫酸卡那霉素），两种载体均含有T7-1ac启动子，具有不同的复制子，构成相容性双质粒表达系统，在IPTG的诱导下，两个质粒可以共同表达。T7启动子专一于T7RNA聚合酶，高活性的T7RNA聚合酶可以使蛋白的合成速度快于大肠杆菌合成蛋白的4倍。而且本实验使用的表达菌株为大肠杆菌BL21（DE3），是蛋白酶缺陷性菌株，因此有利于外源蛋白的高效表达。重组菌在诱导表达之前，要处于对数期，这时大肠杆菌新陈代谢特别旺盛，为外源蛋白诱导表达做好铺垫。此外，外源蛋白表达还受诱导温度的高低，诱导剂IPTG的浓度，诱导时间的长短等因素有关。林凡等[12]在表达重组别藻蓝蛋白时发现在20℃，28℃目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在，而在37℃时重组蛋白主要以包涵体形式存在。本实验在37℃下表达藻蓝蛋白的荧光强度最高，推测可能是表达重组蛋白含有的表达元件较多，需要在较高的温度下才能使每个元件都得到充分表达。IPTG是乳糖类似物，本身不能菌体细胞所利用，在低浓度（0.1-1 mmol/L）的IPTG完全可以诱导外源蛋白的表达，而高浓度的IPTG对大肠杆菌细胞具有毒害作用，从而影响蛋白的表达水平。外源蛋白在表达时并非诱导时间越长越好，随着表达时间的延长，宿主菌蛋白酶的量逐渐到饱和，反而会降解外源蛋白，使外源蛋白表达量降低，陈卫等[13]研究不同浓度IPTG诱导重组的β半乳糖苷酶表达时，发现当浓度达到0.8mmol/L，蛋白表达量达到最高，在表达4小时后蛋白表达量最高，时间继续延长，蛋白表达量并没有增加。本研究中0.1mmol/L的IPTG诱导2小时最有利于有荧光活性的藻蓝蛋白表达，IPTG浓度再高或者诱导时间继续延长都使得荧光强度降低，可能与形成了包涵体或者外源蛋白被降解有关。通过三因素三水平的正交实验，最终得出在大肠杆菌中表达有光学活性藻蓝蛋白的最优条件为： 37℃，0.1mmol/L IPTG诱导2小时。

蛋白质的稳定性受到各种条件的影响，例如pH值，溶液浓度，溶剂，温度，光强等。刘杨等[10]发现在处于中性pH7.0和pH8.0时，藻蓝蛋白比较稳定，而在pH5.0时，藻蓝蛋白不稳定，其浓度随时间延长不断下降，当pH为3.0与9.0时，藻蓝蛋白很不稳定，浓度急剧下降，说明藻蓝蛋白在中性pH条件更稳定。本实验中使用0.01mol/L PBS溶液，调节pH值为6.0，7.0，8.0，重悬菌体沉淀测得低温荧光，结果发现pH为7.0时荧光强度最高，但是与pH6.0，pH8.0条件下藻蓝蛋白的荧光强度差异并不显著，验证了pH为中性或接近中性时藻蓝蛋白的稳定性较好。张厚森等[11]的研究结果也得出了一致的结论，认为pH在5-8之间稳定，并且还发现浓度小于20mg/mL的NaCl能对藻蓝蛋白起到一定的保护作用，在0.09mg/ml的NaCl溶液中，藻蓝蛋白比较稳定。在本实验中PBS溶液，生理盐水，LB培养基中都含有NaCl约为0.09mg/ml，根据张厚森等的结论，三种溶剂都可以使藻蓝蛋白比较稳定，而三蒸水中由于完全不含有NaCl，缺少对藻蓝蛋白的保护，从而使荧光强度最低。进一步比较0.1mol/L的PBS溶液，生理盐水和LB培养基，由于每一种溶剂又含有不同成份，可能对荧光发射光谱有一定的影响。在我们的实验中，藻蓝蛋白在0.1mol/LPBS中的荧光强度最高。但是有报道称[14]，PBS会影响荧光光谱的测定，浓度越大荧光强度就会减小。因此我们进一步分析了pH7.0条件下的不同PBS浓度对荧光强度的影响，结果发现，用0.1mol/L和0.01mol/L的PBS处理菌体时，荧光强度均很高，二者差异不显著，可见小于0.1mol/L 的PBS既能保持藻蓝蛋白的稳定，又不影响荧光强度的检测。但是高于0.2mol/L 的PBS则会显著影响菌体的荧光强度检测。根据上述结果和分析，我们选择0.01mol/L，pH为7.0的PBS溶液作为处理重组表达菌体的溶剂。本研究有光学活性藻蓝蛋白的重组表达和检测提供实验基础。

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（Ocean University of China/Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding， Ministry of Education， Qingdao 266003， Shandong， China）

[Abstract]In order to optimize the expression leveland the optical activity of the recombinant Phycocyanin （PC）， fragments- ussBcpcBA，cpcE，cpcF，hox1 and pcyAof Arthrospira platensis FACHB314 were transformed into Escherichiacoliand used to synthesizean optical PC.Through orthogonal experiment of three factors and three levels ， the best inducement conditions for the fluorescent PC expressed in Escherichiacoli were as follows： 0.1mmol/L IPTG at 37℃ for 2 hours. The impact of thedifferent treatmentconditions on the low-temperature fluorescence of the expressed PC werestudied to find that the optimal treatment solution for the bacterial precipitation was pH 7.0， 0.01 mol/L PBS. This study laid a foundation for heterologous expression， detection and application of the fluorescent PC.

[Key words]fluorescence；Phycocyanin； expression； optimization