广西卫生厅重点科研课题

【摘要】 目的 研究转化生长因子β1 （TGFβ1）基因869T/C（Leu10Pro）位点多态性各等位基因及基因型在广西人群中的分布频率，对比不同种族之间的分布差异。

方法 采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）技术和DNA测序法检测210例广西人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点多态性，并结合相关文献，比较其在不同种族间的分布差异。

结果 广西人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点表现为TT、TC、CC三种基因型，频率分别为25.2%、50.5%和24.3%。T、C等位基因频率分别为50.5%和49.5%。其基因型和等位基因频率在不同性别间比较，差异无统计学意义（P>0.05），但与埃及人和英国人比较，差异均有统计学意义（P

结论 在广西人群中存在TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点多态性，其基因多态性的分布频率在不同性别间比较差异不显著，但与其他种族人群比较存在显著差异。

【关键词】 转化生长因子β1；基因多态性；种族

中图分类号：R446.7 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.05.001

A study on genetic polymorphism of TGFβ1 gene 869T/C（Leu10Pro） of Guangxi crowd

[HJ2][HJ]

HUANG Huatuo，XIANG Yang，LUO Hongcheng，CHEN Jianming，WU Chengjiang，WEI Yesheng

（Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】 Objective To study allele and genotype frequencies in polymorphisms of TGFβ1 gene 869T/C（Leu10Pro） in Guangxi crowd，so as to analyze the distributions of it among different ethnic groups.

Methods The TGFβ1 gene 869T/C（Leu10Pro） polymorphisms of 210 people in Guangxi were examined by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism（PCRRFLP） method and DNA sequencing.And distribution disparity between different ethnic groups were compared combing with related documents.

Results The TGFβ1 gene 869T/C（Leu10Pro） showed three genotypes：TT，TC and CC，and the frequencies were 25.2%，50.5% and 24.3%，respectively.Allele frequencies of T and C were 50.5% and 495%，respectively.The allele frequencies and genotype distribution of TGFβ1 gene 869T/C（Leu10Pro） had no statistically significant difference between men and women （P>0.05），but difference was statistically significant when comparing with the Egyptians and the British （P

Conclusion There are TGFβ1 gene 869T/C（Leu10Pro） polymorphisms in Guangxi crowd，and difference of its distributions is not significant between men and women，but the difference is significant when comparing with other races.

【Key words】 TGFβ1；polymorphism；race

转化生长因子β1（TGFβ1）为1984年Tucker等发现的一种调节细胞生长的多肽，后被证明为转化生长因子超家族中的一员[1]。后期研究发现，TGFβ1在体内多种细胞中都有表达，如淋巴细胞、血小板、巨噬细胞等。TGFβ1是由两条含有112个氨基酸的分子量为11 KD的单链通过二硫键结合而成的多肽。人类基因组中，用于编码TGFβ1的基因位于第19号染色体长臂（19q13.2）上，总共包含6个内含子和7个外显子。该基因目前已发现的突变位点有十多个，而常见的与疾病有密切联系的有7个，869T/C（Leu10Pro）是其中一个重要的突变位点。相关研究表明[2～7]，TGFβ1基因单核苷酸多态性与纤维硬化性疾病、肿瘤性疾病、免疫性疾病和糖尿病等疾病的发病密切相关。因此，我们采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）技术和DNA测序法检测广西人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点单核苷酸多态，同时探讨其基因多态性在不同种族和地区正常人群间的分布差异，为与TGFβ1基因相关疾病的预防医学和遗传学等方面的研究提供一些前瞻性基础资料。

1 对象与方法

1.1 对象

本次课题研究对象共210例，均为无血缘关系的广西人群。其中男139例，女71例，平均年龄（47.9±10.1）岁，选自2013年6月至2014年4月右江民族医学院附属医院体检人群的随机个体，血常规及其他生化指标均在参考范围之内，排除心血管疾病及癌症家族史，排除肾脏、肝脏和内分泌疾病。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

用EDTAK2抗凝的采血管采集以上健康体检者静脉血3 ml，参照已建立的方法[8]提取白细胞基因组DNA，放于-70℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物设计与合成

依据TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点多态性及已知的DNA序列，利用引物设计网站（http：///cgibin/webprimer）设计PCR引物，委托上海天昊生物科技有限公司合成。用于本次PCR特异性扩增实验的引物，上游引物序列为：5’CCTCCCCACCACACCAG3’，下游引物序列为：5’CGGCA CCTCCCCCTGGCTCG3’。

1.2.3 PCR扩增

TGFβ1 869T/C（Leu10Pro）的PCR扩增反应体系为20 μL，其中含10×PCR 缓冲液2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，用灭菌双蒸水补充其余不足体积至20 μL。TGFβ1 869T/C（Leu10Pro）的循环参数为：94℃预变性反应5 min；94℃变性40 s，66℃复性50 s，72℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸8 min。

1.2.4 PCR扩增产物的限制性酶切

TGFβ1 869T/C（Leu10Pro）的扩增产物用2 U MspA1I于37℃酶切2 h；PCR产物限制性酶切所用内切酶来自英国Biolabs有限公司。TGFβ1 869T/C（Leu10Pro）酶切产物于8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，染色后在紫外灯下观察结果，并用BioRad自动凝胶成像及分析系统进行成像和分析。为进一步证实结果，我们将PCR产物送上海英俊生物技术公司进行DNA序列测定。

1.3 统计学方法

基因型和等位基因频率采用直接计数法计算，各组间基因型及等位基因频率的比较采用χ2检验，所有数据计算和比较均在SPSS 130软件上完成，P

2 结 果

2.1 TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点基因型检测结果

本次PCR扩增实验产物的片段大小为268 bp，依据限制性内切酶MspA1I酶切片段情况，TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点基因型有3种，TT型（103，67，58和40 bp 4条带），TC型[103，91，67，58，40和12 bp （跑出胶外，没有显示） 6条带]，CC型（91，67，58，40和12 bp 5条带）。PCR扩增产物及酶切产物电泳结果如图1和图2所示。后续的DNA测序进一步证实了我们的结果（如图3所示）。

2.2 广西人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点基因型和等位基因在不同性别间分布频率的比较

经χ2检验法计算，广西健康人群TGFβ1基因的基因型和等位基因频率分布符合HardyWeinberg遗传平衡（哈迪温伯格平衡），表明本次研究所选的样本具有良好的群体代表性。广西人群中，TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点包含TT、TC和CC基因型，以TC（50.5%）型频率最高，TT基因型次之。等位基因频率中以T（50.5%）最高。广西人群中，TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点基因型和等位基因频率分布在不同性别间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

图1 TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点PCR扩增产物8%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

图2 TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）酶切产物8%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。M：DNA标准分子量；1，2，8：TT基因型；3，6，9：TC基因型；4，5，7：CC基因型。

图3 TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）测序图：A、B、C分别表示CC、TC、TT基因型；箭头所示为基因突变位点。

2.3 不同种族及地区人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点基因型和等位基因频率的比较

广西人群中，TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点基因型和等位基因频率与英国人[9]和埃及人[10]比较，差异均有统计学意义（P0.05）。见表2。

3 讨 论

长期的分子生物学研究发现，在人类基因组中存在普遍的基因多态现象。随着分子生物学研究技术的日新月异，人们对基因多态性的认识有了突破性的进展，基因多态性的研究逐渐成为解释人体对某些疾病或毒物的易感性与耐受性及疾病临床表现的多样性和对药物治疗的反应性等现象的内在机制。然而，研究正常人群基因多态性分布是我们进一步研究致病基因多态性分布的前提和基础。正常人群基因多态性分布的研究，将为我们探索致病基因及易感基因的分布特点、疾病的发病机制提供前瞻性资料。

TGFβ1是转化生长因子超家族中的一员，广泛表达于多种细胞，包括活化的T细胞、B细胞和多数肿瘤细胞等表面。研究表明，TGFβ1通过调节淋巴细胞的增殖、分化及抑制NK细胞的增殖和杀伤等方式起到免疫抑制作用，这对于维持机体免疫系统稳定有着重要作用。然而，在病理情况下，TGFβ1通过其免疫抑制作用损伤机体的免疫监督功能，使机体失去对自身抗原、外来抗原及肿瘤相关抗原等抗原异物的正常免疫应答，最终导致自身免疫性疾病或肿瘤的发生[16]。人类编码TGFβ1的基因位于第19号染色体长臂（19q13.2）上，分子生物学研究表明，TGFβ1基因存在869T/C（Leu10Pro）位点单核苷酸多态性，这些多态性位点的存在可能影响TGFβ1基因的功能，从而可能导致与之相关疾病的发生和发展。TGFβ1基因存在多个SNP位点，国内外相关研究[2～7]发现，这些多态性位点与纤维硬化性疾病、肿瘤性疾病、免疫性疾病和糖尿病等疾病的发生和发展有着密切联系，而869T/C（Leu10Pro）是其中一个重要位点。因此，正常人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点多态性分布的研究显得很有必要，其研究成果将为与TGFβ1基因相关疾病的预防和治疗提供一些基础理论依据。

为此，我们运用PCRRFLP技术和DNA测序法检测广西地区正常人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点基因型和等位基因频率的分布情况。结果显示，在广西人群中，TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点表现为TT、TC、CC三种基因型，频率分别为25.2%、50.5%和24.3%；等位基因T、C频率分别为50.5%和49.5%。其基因型和等位基因频率分布在不同性别间比较，差异无统计学意义（P>005）。进一步将检测结果同英国人[9]、埃及人[10]、日本人[11]、包头汉族人[12]、宁夏汉族人[13]、广东汉族人[14]和青岛汉族人[15]比较发现，广西人群TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点基因型和等位基因频率与英国人和埃及人比较，差异均有统计学意义（P0.05）。通过本次研究结果可以发现，TGFβ1基因869T/C（Leu10Pro）位点基因型和等位基因频率在不同种族间比较存在较大差异，但与同一种族不同人群比较差异较小。这一结果符合“亲缘关系越近的，其基因型的分布差异越小，反之则差异越大”的遗传学规律。

总之，研究我国广西地区正常人群TGFβ1基因单核苷酸多态性的分布特征，将有助于我们更深入地了解这些疾病在广西人群的基因背景，为相关疾病的预防和治疗提供基础理论依据。同时，将其多态性分布与不同种族和地区人群比较，将为群体遗传学和人类学研究提供基础性参考资料。

参 考 文 献

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（收稿日期：2015-08-05 修回日期：2015-10-22）