时间：2022-08-01 04:40:20
[摘要] 目的：观察优化设计的串联序列amiRNA（artificial microRNA）质粒表达载体长期干扰乙型肝炎病毒（HBV）后，对HBV复制源泉cccDNA的影响。方法：将前期构建的针对HBV RNA干扰效率高的单一序列及串联序列amiRNA质粒表达载体，瞬时转染入HepG2.2.15细胞，筛选出稳定转染细胞株，观察其对cccDNA的影响。结果：稳定转染单一序列amiRNA-HBV-4组相对于阴性对照质粒，对HBV cccDNA的抑制率为93.78%；串联序列amiRNA-HBV3-4组为99.65%，二者比较，差异有高度统计学意义（P
[关键词] 乙型肝炎病毒（HBV）；amiRNA；串联序列质粒表达载体；稳定转染；cccDNA
[中图分类号] R512 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2011）11（a）-020-04
Influence of the tandem sequence expression plasmids of amiRNA against HBV cccDNA
PU Chunwen1,2, WANG Lifen3*, ZHANG Yong2, LIU Wei1, ZHANG Ying1, CONG Shurong1
1.The Sixth People′s Hospital of Dalian City, Liaoning Province, Dalian 116033, China; 2.Dalian Medical University, Liaoning Province, Dalian 116033, China; 3.The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Liaoning Province, Dalian 116033, China
[Abstract] Objective: To observe the effect of cccDNA after the long-term inhibition of tandem sequence amiRNA plasmids expression vector against HBV. Methods: The earlier constructed amiRNA plasmids of singular and tandem sequences against HBV were transfected into HepG2.2.15 cells transiently. Then the cells which stably expressed miRNA were screened. Last cccDNA were measured to observe the long-term inhibition efficiency. Results: HBV cccDNA remarkably decreased in amiRNA-HBV-4 group by 93.78% compared with the negative control plasmid group; amiRNA-HBV3-4 group by 99.65%, there was a significant difference between them (P
[Key words] HBV; amiRNA; Tandem sequence plasmids expression vector; Stable transfection; cccDN
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒感染导致的传染病，目前已成为全球重要的公共卫生问题[1]。近几年抗病毒治疗的临床研究证实，只要血清中HBV病毒量持续阴性，患者的病情即会有根本性好转，包括病理方面的改善。尽管抗病毒药物的出现为乙型肝炎的治疗带来了一线曙光，但目前临床的抗病毒药物都存在一定的局限性[2]。1998年Fire等首次提出RNAi（RNA interference）这一概念后，对于乙型肝炎病毒的研究从最初的化学合成siRNA（small RNA interference）、shRNA（short hairpin RNA）质粒载体及病毒载体等，向microRNA的研究过渡[3]。microRNA在人体内可自然存在的特点，使它的应用性较siRNA更强。
肝细胞内持续的HBV感染以核内共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的存在为特征，被认为是病毒持续存在和重新激活的重要因素[4]。细胞内cccDNA的含量远低于rcDNA，但其一直是HBV持续感染及抗病毒药物停用后复发的关键因素，只有清除或有效降低cccDNA，才能彻底消除乙型肝炎病毒[5]。cccDNA的半衰期较长，故只有对其进行长期干扰研究对其的影响才更有意义，稳定转染可达到观察目的。RNAi抑制HBV的大多数研究都是瞬时转染的，不同的质粒在细胞或体内转染的效率不同，不利于确切地观察RNA干扰的治疗效果。通过基于载体的质粒在细胞内表达miRNA或siRNA经济方便，还可进行稳定转染，使小干扰RNA持续表达，延长对目的基因的抑制时间。为进一步证实外源性串联序列amiRNA介导的RNA干扰对HBV确切地抗病毒效果，笔者进行了稳定转染，以观察amiRNA对HBV的确切抑制效果。目前临床应用的抗病毒药物也都需要进行长期治疗，包括干扰素、核苷酸类似物，所以稳定转染更能接近临床研究情况。
amiRNA即人工合成的microRNA技术，是指利用外源性基因在体内形成microRNA前体分子使其产生小RNA，从而介导动物或植物中的靶基因沉默的技术。本文旨在应用amiRNA这一新技术，针对HBV基因容易变异的特点，前期构建了优化设计的同时靶向HBV S区两个位点的新型串联序列质粒表达载体，稳定转染入HepG2.2.15细胞，观察其对HBV复制根源cccDNA的长期影响。既往有研究单一序列amiRNA对RNA及其蛋白表达进行研究，但未见有串联序列amiRNA对HBV尤其是cccDNA的研究，本文为进一步进行体内实验奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
利用pcDNA6.2-G/W-EmGFP-miR表达载体构建的单一序列质粒表达载体amiRNA-HBV-4（简称amiHBV-4），和串联序列质粒表达载体amiRNA-HBV3-4质粒（简称amiHBV3-4）为本实验室前期构建，已经琼脂糖凝胶电泳和基因测序验证构建成功。阴性对照质粒表达载体由美国Invitrogen公司提供。稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞系由第二军医大学附属长征医院的缪晓辉教授惠赠，本室保存。Lipofectemin2000转染试剂（美国Invitrogen公司）。稳定转染筛选细胞应用的主要试剂为杀瘟稻霉素/Blasticidin、G418（美国Invitrogen公司）。HBV cccDNA的检测采用上海复星公司的HBV cccDNA PCR荧光实时定量检测试剂盒。HBsAg和HBeAg检测采用雅培试剂盒（购于美国Abboutt公司），Axsym全自动免疫分析仪购自美国Abboutt公司。
1.2 方法
1.2.1 杀瘟稻霉素浓度的确定及细胞克隆的筛选 确定Blasticidin的最佳抑制浓度：由于抗生素Blasticidin的不同批次以及不同细胞敏感度不同，笔者制备了抗生素致死曲线来确定筛选浓度，即设定 Blasticidin梯度为0、2、5、10、15和20 mg/L 6个筛选浓度。取复苏后传代的第二代细胞，调整细胞密度为1.5×104/ml，每孔0.5 ml，加入24孔培养板，然后每孔加入含10%FBS的DMEM培养液0.5 ml，37℃传代培养，24 h后加入Blasticidin筛选。每3天换一次培养基，加入Blasticidin，每日显微镜下观察并记录细胞的生长情况，PBS洗净死亡的细胞。靶细胞抗生素最佳筛选浓度为可在3 d内导致大量的细胞死亡，并在2周内杀死所有细胞的浓度，作为转染后细胞筛选时的初筛浓度。笔者首先选择在瞬时转染实验中对HBV抑制效果最好的amiHBV-4、amiHBV3-4质粒和阴性对照质粒同时进行了瞬时转染，转染后筛选稳定细胞株。经对HepG2.2.15细胞以不同浓度的Blasticidin加压，根据细胞致死曲线变化，确定10 mg/L的浓度为筛选克隆株的初筛浓度，5 mg/L作为维持浓度。经Blasticidin和G418共同筛选6周后获得了稳定表达miRNA的单克隆细胞株，供进一步实验研究。共获取包括阴性质粒对照在内的稳转细胞株3株。再次送上海锐赛公司测序，结果证实插入序列均无变异，表明细胞株中的质粒DNA没有被破坏和发生变异。
1.2.2 cccDNA的检测 选择在瞬时转染实验中对HBV抑制效果最好的amiHBV-4和amiHBV3-4质粒和阴性表达质粒同时进行了稳定转染，筛选出稳定表达amiRNA质粒的稳转细胞株。应用上海复星公司的HBV cccDNA PCR荧光实时定量检测试剂盒，取培养细胞提取的细胞内总DNA进行检测。具体操作均严格按照仪器和操作说明书进行。
1.2.3 稳定转染amiRNA-HBV对HBsAg和HBeAg的抑制作用 筛选出稳定表达amiRNA质粒的细胞株后，取各孔上清液按试剂盒说明进行检测。
1.3 统计学方法
所有数据输入Excel 表格，采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。抑制率的计算方法：inhibitory rate（%）=[（Ccontrol-Ctester）/Ccontrol]×100%。
2 结果
2.1 稳定细胞株的筛选
经筛选获得了稳定表达miRNA的单克隆细胞（图1，见封三），单克隆细胞扩增得到细胞株（图2，见封三）。
2.2 cccDNA的PCR检测
2.2.1 瞬时转染amiHBV后对HBV cccDNA的抑制情况（图3） 荧光实时定量PCR检测结果显示，相对于阴性对照质粒，瞬时转染amiHBV-4组对HBV cccDNA的抑制率为21.9%，降低值为1.996log10 copies/ml；amiHBV3-4组降低值为2.422log10 copies/ml，对HBV cccDNA的抑制率分别为58.4%。抑制率是以72 h各组cccDNA含量与阴性对照质粒组之间进行比较得出的结果，log10 copies/ml的结果是对表内数值取常用对数。
2.2.2 稳定转染amiHBV后对HBV cccDNA的抑制情况（图4） 相对于阴性对照质粒，稳定转染amiHBV-4组对HBV cccDNA的抑制率为93.78%，降低值为2.566log10 copies/ml；amiHBV3-4组对HBV cccDNA的抑制率为99.65%，降低值为2.592log10 copies/ml。该抑制率的计算是以各组cccDNA的检测平均值水平与阴性对照质粒组cccDNA的平均值相比较得出的结果，log10 copies/ml的结果是对表内数值取常用对数。
2.3 稳定转染amiRNA-HBV对HBsAg和HBeAg的抑制作用
因为HBsAg和HBeAg均为可溶性抗原，所以检测细胞上清液中的含量即可。检测结果显示，与HepG2.2.15细胞相比，转染了阴性质粒的稳定株的HBsAg和HBeAg的分泌差异无统计学意义（P>0.05）；而在转染的amiHBV-4质粒组和amiHBV3-4质粒组对HBV的表达均显示了显著的抑制效果（图5），其中，amiHBV-4质粒组对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为96.50%和97.18%，amiHBV3-4质粒组为97.00%和96.97%（P
3 讨论
HBV DNA的复制机制较复杂，复制周期始于cccDNA，以其为模板利用宿主细胞的酶转录为前基因组RNA，逆转录为负链DNA，再合成正链DNA，双链DNA又成熟为cccDNA，其作为HBV复制的根源在近几年来越来越受到重视[7]。作为体外常筛选抗HBV药物的靶细胞，已有研究证实于HepG2.2.15细胞的培养基上清液、HBV感染免疫缺陷的大鼠血清及人血清中都存在HBV cccDNA，血清与肝内HBV cccDNA的相对比值较低，其来源不清楚，可能与感染肝细胞的溶解有关[4]。有研究专门对HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA的表达进行了动态观察，应用PCR方法在细胞内DNA中扩增出了cccDNA，经测序证实cccDNA存在于HepG2.2.15细胞中[7]。
有研究指出在HBV感染过程中，cccDNA可以微型染色体的形式稳定地存在于细胞核中，一般平均每个感染的肝细胞存在5~70个拷贝[8]。HBV cccDNA十分稳定地贮存在细胞核中，半衰期比较长，一般认为是35～70 d，且不容易受到抗病毒药物和免疫因素的影响[5]。在研究抗病毒药物对HBV cccDNA的影响时发现，Sung等[9]用拉米夫定单一治疗或联合长效干扰素治疗发现，持续应答患者肝细胞内HBV cccDNA明显较无应答患者低，在预测治疗后持续病原学应答方面优于血清HBV DNA。Wong等[10]进行14例HBeAg阳性的慢乙型肝炎患者的临床观察，报道在恩替卡韦治疗组（7例）48周后血清HBV DNA平均下降5.74log10 copies/ml，肝组织内总HBV DNA和cccDNA分别下降1.75和1.31log10 copies/细胞，降低幅度均大于拉米夫定治疗组。有研究结果表明，针对HBV羧基端的siRNA能显著降低HBV cccDNA的水平和抑制HBV DNA的复制[11]。
为排除转染效率对抑制效率的影响，郜玉峰等[12]针对HBV感染所需的宿主基因设计了amiRNA，并进行了稳定转染试验，在mRNA、DNA及蛋白质水平均验证了对HBV的复制和表达可达到持续抑制的作用。需要指出的是，从筛选到建立稳定株后的3个多月，病毒蛋白的复制和表达均被持久抑制，无明显波动，说明该质粒中的DNA不会轻易被细胞所排斥，能够持续存在。经稳定筛选得到的细胞株能够持续抑制HBV的复制和表达，使得amiRNA技术治疗慢性乙型肝炎具有潜在价值。该实验设计的干扰序列是针对HBV病毒感染和复制所需要的宿主细胞因素进行RNA干扰研究的，对人体的代谢等是否造成不良影响不得而知。本实验针对HBV的病毒基因设计串联序列amiRNA质粒，不会对人体自然存在的基因产生影响。
笔者进行稳定细胞株的筛选研究时，是根据所用质粒的耐药基因选择了Blasticidin和G418。G418是一种氨基糖苷类抗生素，通过影响80 S核糖体功能而阻断蛋白质的合成，对原核和真核等细胞都有毒性。HepG2.2.15细胞中原先已经导入的HBV基因质粒中即带有G418的耐药基因，对它的耐药代表HBV复制基因的存在。Blasticidin属于核苷类抗生素，它能在原核生物和真核生物中抑制其蛋白的合成。amiRNA中的pcDNA6.2-G/W-EmGFP-miR表达载体中带有Blasticidin的耐药基因，对它的耐药代表amiRNA转染质粒的存在。对cccDNA的检测，最早应用的Southern blot法对操作者和仪器设备的技术要求较高，敏感性较低且不能准确定量，难以在临床常规开展。近年来有文献报道用PCR法、套式PCR法以及荧光探针检测技术的选择性PCR扩增法，使得检测的敏感性和实用性都得到了提高[13]。但由于HBV rcDNA和cccDNA序列有高度的一致性，应用PCR法仍可能会造成一定的假阳性率。为提高HBV cccDNA的检测精确度，一般基于其与rcDNA在生化（如对一些核酶的抗性等）和结构特性上的两个重要不同点来避免检测过程中的假阳性结果。①根据碱变性法抽提质粒的原理，细胞基因组DNA、病毒rcDNA和ssDNA（single strand DNA）因不是超螺旋分子，碱变性后在酸性环境下不能复性而被去除。cccDNA和质粒都是细胞内超螺旋的共价闭合环状双链DNA分子，一般不会被核酸外切酶如绿豆核酸酶等降解，而rcDNA可以被这些外切酶降解[14]。②cccDNA的两条共价互补链均是完整的并形成超螺旋结构，而rcDNA的正链和负链只是部分互补均有缺口，不能形成超螺旋结构；根据rcDNA和cccDNA在分子结构上的差异，将PCR引物分别设计在HBV DNA负链中缺口的两侧[15]，使rcDNA不能被扩增。郝勇等[16]单用跨缺口引物实时荧光定量PCR即可使cccDNA检测特异性提高104以上，在荧光PCR之前用特异性核酸酶消化模板，可将cccDNA检测特异性提高至105以上，可完全满足实验室和临床检测的需要。
本实验中使用的HBV cccDNA特异性荧光定量PCR检测试剂盒，先以绿豆核酸酶消化降解具有缺口的rcDNA，再于跨HBV DNA的双缺口区设计引物，使用TaqMan探针，进行PCR检测，从而减少了rcDNA在PCR扩增中的干扰，可以特异性地扩增所需cccDNA。但rcDNA的模板在PCR退火的过程中仍可被扩增，为防止上述情况，需在扩增前用外切核酸酶消化带有缺口的rcDNA[15]。有的检测试剂盒只是利用了选择性PCR扩增法的原理，本实验中采用的上海复星公司的HBV cccDNA PCR荧光实时定量检测试剂盒，是结合了这两个原理，先用绿豆核酸酶特异地降解rcDNA，减少了rcDNA在PCR扩增中的干扰。
虽然HBV是一个DNA病毒，但是其DNA的复制需通过基因组RNA为中介，使得RNA干扰抑制HBV DNA成为可能。相对于RNA病毒在其基因组复制时有一个高的变异率而言，DNA病毒较稳定，但每合成一个核苷酸仍有10-8～10-11的变异率，这样就可能存在一个预先存在的耐药突变位点，逃逸RNA干扰，这在关于HBV的最近研究中被证实[6]。针对病毒常逃逸RNAi作用的特点，有学者从对病毒感染和复制都必需的宿主细胞因素入手，导入多个化学合成的siRNA对宿主细胞进行RNA干扰等方面的研究，但是某些宿主基因为正常人体代谢所必需的，所以带来了一定的限制。本实验针对HBV病毒基因的两个位点设计了串联序列amiRNA质粒，该质粒为在前期的实验中构建且已经测序验证的。串联序列可同时靶向2个不同的位点，当一个位点变异逃逸RNAi，该质粒对另一位点序列仍然具有干扰效率。
前期笔者进行了瞬时转染的研究，实验结果显示，串联序列amiRNA-HBV3-4对HBV mRNA的抑制效率最佳，单一序列amiRNA-HBV-4的干扰效率较好；amiRNA-HBV-1和amiRNA-HBV-2的干扰效率分别低于30%，所以在串联序列的选取上就将1和2的序列舍弃。进一步研究了各质粒对细胞内HBV DNA和对病毒蛋白HBsAg、HBeAg的干扰效率。总体来看，amiRNA-HBV-4组和amiRNA-HBV3-4组对HBV的干扰效果较好，故本实验对二者瞬时转染后HBV cccDNA的情况进行了研究，amiRNA-HBV-4组的抑制率为21.9%，amiRNA-HBV3-4组为58.4%。稳定转染后amiRNA-HBV-4组对HBV cccDNA的抑制率达到了93.78%，而amiRNA-HBV3-4组为99.65%。稳定转染后两组对HBsAg和HBeAg的抑制率较瞬时转染时明显提高。实验证明，针对S区域的串联序列amiRNA介导的RNA干扰作用，对HBV的表达有明显的抑制作用，对DNA的复制根源的干扰作用更加明显。串联序列质粒干扰效率高的原因，考虑可能为：两个针对同一个基因的RNA干扰序列的设计，互补克服了可能存在病毒变异可能的缺陷；两个amiRNA序列，相当于两把锋利的剪刀，同时去剪一批绳子，剪断的速度比一把剪刀要快。本研究结果证明，针对保守区域及串联amiRNA表达载体的设计，可更有效地抑制HBV病毒，并进一步避免了病毒的逃逸。
本实验就amiRNA串联序列质粒表达载体抑制HBV的效果进行了多方位的观察，为其应用于临床抗乙型肝炎病毒治疗做基础准备。众所周知，病毒性乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，有庞大的患者群，医疗保险承担的医疗费用支出相当大。近几年的临床观察，只要HBV持续阴性，病情即会有根本好转。目前的抗病毒治疗仍然存在难题，而没有一种上市的药物是专门针对HBV mRNA的，如果能使miRNA应用于临床，将极大地减轻社会的负担。
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（收稿日期：2011-04-27）