香蕉植株内生细菌群落的PCR-DGGE分析

摘要: 以健康香蕉植株和感染香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC）后的香蕉植株的根茎叶组织为材料，提取样品中的总DNA，扩增细菌的16S rDNA的V3可变区，对扩增产物进行DGGE电泳分析，并对其中18条优势条带进行切胶回收、克隆测序和系统发育分析。结果表明，香蕉健株与病株各组织中所含内生细菌的种群丰富度为根部＞假茎＞叶片；感病植株组织内生细菌种类比健康植株丰富；BLAST结果为大部分克隆序列与已知细菌16S rDNA基因序列的同源性较高（94%~100%），分别归属于蓝细菌门（Cyanobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）、变形杆菌门（Proteobacterium）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和绿菌门（Chlorobi）7大类群；其中一个序列同源性较低（91%），可能代表新的分类单元。

关键词: 香蕉；内生细菌；DGGE；群落结构；多样性

中图分类号：Ｓ６６8．1 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０（２０12）０2－0235－０6

Analysis of entophytic bacteria community structure in banana by PCR-DGGE technique

LIU Fei-fei，LI Chi*，LIU Yong-qin，YU Li

（College of Agriculture， Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088 China）

Abstract: The total genomic DNA was extracted from various tissues of both the healthy bananas and the ones which were infected with Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC）. Then the 16Sr DNA V3 fragment polymerase chain reaction products amplified from the total genomic DNA were analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）. The results of sequence analysis of the 18 DGGE dominant bands showed that the population abundance of endophytic bacteria contained in the healthy banana plants and the infected plants was different. The most abundant population was found in roots ，the middle in the bulb tissue and the least in leaves; The abundance of endophytic bacteria increased after infection with FOC; And most of the sequences were phylogenetically close to Cyanobacteria， Chloroflexi， Actinobacteria， Proteobacterium， Bacteroidetes， Firmicutes and Chlorobi； But the homology for one of the sequences was only 91%. It may represent a new taxon.

Key words： Banana； Entophytic bacteria； Denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）； Community structure； Diversity

植物内生细菌是一类在健康植物栖居，对植物无害并与植物建立和谐关系，广泛存在于植物根、茎、叶、花、果实和种子等器官中的微生物群落[1]。植物内生细菌具有宿主特异性，同一宿主植物的不同器官、生育期及宿主所处的环境条件的不同，其内生细菌群落结构也不同[2]。目前，内生细菌的研究主要集中在内生细菌的分离鉴定、植物病害的生物防治、对宿主植物的促生作用以及内生细菌种群多样性研究等领域[3-5]。在研究方法上以传统的分离培养方法为主，但是由于培养条件的限制，可培养细菌种群数量仅占细菌总数0.1%~10%，90%以上的微生物不能进行人工培养[6]。所以，分离培养技术不能全面、准确反映微生物种群多样性概况。PCR-DGGE技术是近几年发展起来的一种技术，在分析微生物群落结构和多样性的研究中具有检测极限低，分离快速、简便、重复性好和同时分析多个样品的优点。目前PCR-DGGE技术在湿地[7]、污水[8]、海洋[9]等领域微生物多样性的研究应用比较广泛，在植物内生微生物多样性的研究中也有应用[10]。

在香蕉内生细菌多样性的研究中，国内付业勤等[11]对健康香蕉植株可培养细菌进行了研究，明确了可培养细菌在香蕉植株不同器官中的数量分布，不动杆菌属（Acinetobacter）等9种内生细菌对香蕉枯萎病菌有抑制作用。潘羡心用16S rDNA序列分析法证明了香蕉根部具有丰富的内生细菌[12]。我们采用非培养方法，利用PCR-DGGE分子生物学技术，研究香蕉内生细菌群落多样性，揭示香蕉不同器官健株与病株组织内生细菌群落结构的差异，对了解香蕉和开发新的微生物资源具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

供试菌种: 2009年从湛江硇洲岛采集香蕉枯萎病害标本，经过分离、鉴定，获得的纯化菌株Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC），菌株编号HMGDOU40928，保存在广东海洋大学植保科技中心。

供试香蕉苗: 香蕉苗株高30~40 cm，5~6片叶子，品种为巴西蕉。

1.2 主要试剂

DNA marker、DNA Taq 聚合酶、DNA纯化试剂盒、pMD18-T载体试剂盒、大肠杆菌DH5感受态细胞，购自TAKARA；PCR引物338F-GC、518R、338F、M13-47和M13-48，由上海生工生物技术有限公司合成。

1.3 香蕉苗接种及表面消毒

香蕉苗进行伤根接种[13]，孢子浓度为106 cfu・mL-1，每个处理香蕉苗30株，以无菌水为空白对照。各处理的香蕉苗，置室温常规盆栽。40 d后的香蕉苗根茎叶各组织进行表面消毒处理[14]，同时将最后一次冲洗水150 μL涂于LB平板上，28 ℃培养72 h，检测表面灭菌效果，然后用于提取植株组织总DNA。

1.4 组织总DNA提取与纯化

参照沈洪等[15]改良的CTAB法提取香蕉根部、假茎、叶片的总DNA。总DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，以Hind III DNA Marker做分子质量DNA，用Gel Red染色后在紫外凝胶成像系统（美国Bio-Rad GelDoc XR+）中观察，拍照。

1.5 16S r DNA V3区PCR的扩增

以降落式PCR[16]扩增细菌16S rDNA的V3区片段。选择细菌的16S rDNA的V3区通用引物338F-GC（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGG GCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和518R（5’-ATTACCGCGGCTG CTGG-3’），提取得到的总DNA适当稀释后做模板进行PCR。PCR体系: 10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL（2.5 mmol・L-1），引物各1 μL（10 μmol・L-1），模板DNA 2 μL，Taq酶 0.5 μL（5 U・μL-1），加双蒸水至50 μL。PCR反应条件: 94 ℃变性10 min，94 ℃变性1 min，65 ℃（-1 ℃/循环）退火1 min，72 ℃延伸2 min，共10个循环，然后94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共20个循环，最后再72 ℃下延伸10 min。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行检测，后用于DGGE分析。

1.6 各组织的DGGE电泳及图谱分析

DGGE（南京，DGGE-1102）条件为: 聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，电泳缓冲液为1×TAE，设置凝胶变性梯度为45%~70%[17]，每孔上样量为20 μL PCR产物与8 μL 10×加样缓冲液。电泳温度为60 ℃，A段电泳电压60V，45 min，B段电泳电压120V，10 h。银染后拍照分析。

所得的DGGE图谱用Bio-Rad QUANTITY ONE 4.3.0软件处理，对各个组织样品条带进行分析。根据各个样品在DGGE图谱中的显示，对其相似性进行聚类分析，来比较各样品中的细菌落结构和多样性。

1.7 DGGE条带克隆测序及系统发育树的分析

将优势条带进行切胶回收，4 ℃无菌水中浸泡过夜。以上清液为模板，引物338F（不带GC夹子）和518R进行16S rDNA V3区的PCR扩增，扩增产物用纯化试剂盒进行纯化。纯化后的产物与pMD18-T载体16 ℃连接3 h，再用热激法转化进大肠杆菌 DH5感受态细胞。在含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB培养基上，37 ℃过夜培养，筛选出具有氨苄青霉素抗性的白色菌落转化子。利用载体通用引物M13-47（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’）和M13-48（5’-AGCGG ATAACAA TTTCACACAGGA-3’）进行菌落PCR检测，筛选出阳性菌落后，进行摇菌培养，送到上海博尚生物技术有限公司测序。

序列通过分析比对后去掉载体序列提交到Gen Bank进行blast比对。选出同源性最高的序列作为参照菌株，用软件Clustal X比对后，用MEGA 5软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 样品总DNA的提取和16Sr DNA V3区的扩增

采用改良后的CTAB方法提取香蕉组织样品的总DNA，具有较为完整的细菌基因组DNA。且最后一次淋洗水150 μL涂于LB平板上，28 ℃培养72 h，无菌落生长。选择细菌的16S rDNA的V3区通用引物338F-GC和518R对纯化后的各样品的总DNA进行PCR扩增，所得到的DN段均为单一条带（图1），片段大小约为180 bp，说明扩增产物无明显的非特异性扩增现象。

2.2 DGGE的图谱及分析

对香蕉植株在感染FOC前后各组织内生细菌的种群多样性的DGGE图谱（图2-I）采用Bio-Rad QUANTITY ONE 4.3.0软件进行分析，结果见图2-II。

从DGGE电泳图谱中可以看出植株各组织中内生细菌种类丰富，且差异性较大。健株的根、茎、叶组织中至少存在22、20和15种不同的内生细菌，病株中至少存在30、27、24种，且感病植株内生菌种类明显比健康植株丰富。1号、2号等条带较亮，代表健康植株和发病植株中均存在的优势菌种。5号为病株根部特有条带，9号、11号、13号为病株假茎特有条带，17号为病株叶片特有条带（图2-I）。

不同组织样品间条带的异同，反映了组织之间细菌群落的相似性和差异性。表1列出了各样品之间内生细菌相似性结果: 各样品间的细菌群落相似性系数各不相同；同一植株不同组织相似性系数差异性显著，根、茎、叶内生细菌群落相似性系数都依次降低，健株分别为66.9%、55.0%、43.6%，病株为70.3%、58.0%、46.2%。健株和病株的同类组织的相似性系数较高，根、茎、叶组织内生菌相似性系数分别为75.5%、78.9%、72.0%。

2.3 优势条带的系统发育分析

将DGGE图谱上比较亮的18个条带进行回收、克隆、测序，所得序列大小为180 bp左右。通过用BLAST与GenBank数据库序列比对分析，17个条带所测序列与数据库中序列相似性在94%~100%（表2），分别归属于蓝细菌门（Cyanobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）、变形杆菌门（Proteobacterium）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和绿菌门（Chlorobi） 7大类；另外，4号条带序列与GenBank登陆号为GQ243083的Proteobacterium关系最为密切，相似率只有91%，推测香蕉内生细菌群落中可能存在新的种群。

从系统发育树可见，7个序列归属于蓝细菌门Cyanobacterium，占所测序列的38.9%，相似性在98%~100%。7号条带为拟杆菌门的新鞘氨醇杆菌属Novosphingobium sp.，是18个阳性克隆中唯一的可培养细菌。绝大多数为不可培养细菌，占94.4%。由图2-I分析出，1号和2号比较亮的条带分别与放线菌属（Actinomyces sp.）、绿弯菌门（Chloroflexi）同源性较高，2者是健康与发病的香蕉植株都存在的优势菌群。

3 讨 论

在研究植物内生细菌时，为避免表面其他微生物的污染，减少腐生细菌DNA残留问题[15]，应对材料进行严格的表面消毒，尽量取植物的内部组织进行总DNA的提取，同时将最后一次冲洗水进行涂平板检测表面消毒效果，直到培养至无菌落出现为止，这样才能保证DGGE电泳产生的条带能反应出组织内生细菌种群的多样性。

内生细菌在香蕉根、假茎、叶片中的菌落丰富度和种群数量存在差异。各组织中细菌丰富度为根部>假茎>叶片，呈递减趋势，根部内生细菌数量最丰富，与罗明等[18]文献研究结果一致。这可能与土壤中栖息着丰富的细菌种类并可以进入香蕉根部有关。从DGGE电泳图谱中可以看到感病植株组织内生菌种类比健康植株丰富，与王爱华等[19]研究结果一致，可能与植株感病后的自身抵抗力降低，细菌容易侵入有关。同一植株根、假茎和叶片内生细菌群落相似性系数依次降低，推测大部分内生细菌群落是由根向茎再向叶扩展分布的，也就是说内生细菌可能是种苗携带或者通过根部侵入。

研究表明细菌数量超过群落细菌数量1%才可以通过PCR-DGGE检测出来[20]，因此系统中的弱势菌群有可能被漏检，所以香蕉植株具有丰富的内生细菌资源并可能存在未被认知的新物种。对18条带进行切胶回收并克隆测序，分别属于7个细菌类群，其中变形杆菌门（ Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）类群与胀果甘草内生细菌的菌群比较相似[21]。放线菌是一类重要的生防菌类群，曹理想等[22]用传统分离方法研究香蕉内生放线菌和真菌多样性，共分离156株内生放线菌，优势菌株与本研究结果不同，本研究所测序得到的放线菌类中是否存在香蕉枯萎病菌的拮抗放线菌，仍需深入研究。绿弯菌门（Chloroflexi）等几个类群均为不可培养细菌[23]，香蕉内生细菌研究中还未见报道。在所得香蕉植株内生细菌中，蓝细菌门Cyanobacteriu的有关菌占35%，为优势菌群。研究中发现香蕉植株发病后所出现的特征条带，分别为5、9、11、13和17号带，这些特有条带80%为蓝细菌门（Cyanobacteri）的细菌。有报道称蓝细菌与苏铁[24]、小叶满江红[25]等低等植物形成共生固氮体系，蓝细菌与香蕉的相互关系还未见报告。蓝细菌门（Cyanobacteri）、变形杆菌门（ Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、绿菌门等不可培养内生细菌的作用及与寄主植物之间的相互关系，还有待进一步研究。

PCR-DGGE方法研究植物内生细菌多样性，初步揭示香蕉植株感染枯萎病菌前后的内生细菌的种类以及不同组织种类的变化情况。这种PCR-DGGE的方法可用于确定不能进行纯培养的内生细菌的种类，与以往分离培养直接形态观察的方法相比，扩大了人们对内生细菌的研究视野，丰富了内生细菌资源，可以提供更多的内生细菌种群信息。DGGE的方法有助于深入了解病原菌与内生细菌之间在寄主植物中相互作用的关系，从而为植物病害的防治提供新的思路。

参考文献 References:

[1] ZINNIEL D K，LAMBRECHT P A，HARRIS B N， FENG Z Y，KUCZMARSKI D，HIGLEY P，ISHIMARU A C，ARUNAKUMARI A，BARLETTA G R，VIDAVER K A. Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（5）:2198-2208.

[2] SURETTE A M，STURZ V A，LADA R R，NOWAK J. Bacterial endophytes in processing carrots[J]. Plant and Soil，2003（253）: 381-390.

[3] TING S A，MEON S，KADIR J，RADU S，SINGH G. Endophytic microorganisms as potential growth promoters of banana[J]. Biocontrol，2008，（53）: 541-553.

[4] YANG Hai-lian，SUN Xiao-lu，SONG Wei. Study of endophytic bacteria in plant[J]. Microbiology，1998，25（4）: 224-227.

杨海莲，孙晓璐，宋未． 植物内生细菌的研究[J]． 微生物学通报，1998，25（4）: 224-227．

[5] HALLMANN Q A，HALLMANN J，KLOEPPER W J. Bacterial endophytes in cotton location and interaction with other plant-associated bacteria[J]. Can J Microbiol，1997，（43）: 254-259.

[6] AMANN R I，LUDWIG W，SCHLEIFER K A. Phylogenetic identification and in situdetection of individual m icrobial cells without cultivation[J]. American Society for Microbiology，1995，59（1）: 143-169.

[7] LIU Hui-jie，YANG Cai-yun，TIAN Yun，LIN Guang-hui，ZHENG Tian-ling. Analysis of microbial community structure in mangrove sediments by PCR- DGGE technique[J]. ACTA Microbiologica Sinica，2010，50（7）: 923-930.

刘慧杰，杨彩云，田蕴，林光辉，郑天凌． 基于PCR-DGGE技术的红树林区微生物群落结构[J]． 微生物学报，2010，50（7）: 923-930．

[8] WU Q，ZHAO X H，ZHAO S Y. Application of PCR-DGGE in research of bacterial diversity in drinking water[J]. Biomedical and Environmental Sciences，2006，（19）: 371-374.

[9] SANCHEZ O，GASOL M J，MASSANA R，MAS J， PEDROS-ALIO C. Comparison of different denaturing gradient GEL electrophoresis primer SETS for the study of Marine bacterioplankton communities[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007，73（18）: 5962-5967.

[10] LIU Lin，LIU Yang，SONG Wei. Application of PCR-DGGE technology in the research of Micro-Ecology in the plants[J]. Biotechnology Bulletin，2009（3）: 54-56.

刘琳，刘洋，宋未． PCR-DGGE 技术及其在植物微生态研究中的应用[J]． 生物技术通报，2009（3）: 54-56．

[11] FU Ye-qin，CAI Ji-miao，LIU Xian-bao，HUANG Gui-xiu. Isolation，Bioactivity evaluation and quantitydistribution of endophytic bacteria in banana[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，2007，28（4）: 78-85.

付业勤，蔡吉苗，刘先宝，黄贵修． 香蕉内生细菌分离、活性评价及数量分布[J]． 热带作物学报，2007，28（4）: 78-85．

[12] PAN Xian-xin，LIU Xian-bao，SHI Tao，LIN Chun-hua，CAI Ji-miao，HUANG GUI-xiu. A diversity research of endophytic bacteria living in banana root with16Sr DNA sequences analysis[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，2010，31（5）: 772-776.

潘羡心，刘先宝，时涛，林春花，蔡吉苗，黄贵修． 16SrDNA序列分析法对香蕉根部内生细菌种群多样性初析[J]． 热带作物学报，2010，31（5）: 772-776．

[13] FANG Zhong-da. Research methods of plant disease[M]. Beijing: China Agriculture Press，1998.

方中达． 植病研究方法[M]． 北京: 中国农业出版社，1998．

[14] REITER B，PFEIFER U，SCHWAB H，SESSITSCH A. Response of endophytic bacterial communities in potato plants to infection with Erwinia carotovora[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（5）: 2261-2268.

[15] SHEN Hong，CHEN Ming-jie，ZHAO Yong-chang，PAN Ying-jie. PCR-DGGE identification of endophytes in morels[J]. Acta Agriculturae Shanghai，2008，24（2）: 58-60.

沈洪，陈明杰，赵永昌，潘迎捷． 羊肚菌内生细菌DGGE鉴定[J]．上海农业学报，2008，24（2）: 58-60．

[16] MUYZER G，WAAL C D，UITIERLINDEN G A. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient GEL electrophoresis analysis of polymerase chain Reaction-Amplified genes coding for 16Sr RNA[J]. Applied and Environmental Microbiology，1993，59（3）: 695-700.

[17] HOU Xiao-jie，CUI Jian-zhou，LI Zheng-nan，YU Zhan-jing，NIU Xiao-ke，RAN Long-xian. Diversity analysis of microbial community from the fruit of jujube fruit shrink diseaseby PCR-DGGE[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2010，10（4）: 260-266.

侯晓杰，崔建州，李正楠，于占晶，牛晓科，冉隆贤． 枣缩果病果实内微生物种群多样性的PCR-DGGE分析[J]．中国食品学报，2010，10（4）: 260-266．

[18] LUO Ming，LU Yun，CHEN Jin-huan，JIANG Yun-qiin，ZHANG Xiang-lin. Study on the dynamic change of population density and distribution ofendophytic bacteria in HAMI melon plants in Xinjiang[J]. Arid Zone Research，2007，24（1）: 28-33.

罗明，卢云，陈金焕，姜云琴，张祥林． 哈密瓜内生细菌菌群密度及分布动态[J]． 干旱区研究，2007，24（1）: 28-33．

[19] WANG Ai-hua，YAN You-ping，XIONG Gong-li，LI Yan-fang，LI Jia，XIAN Jia-xu，WANG Zhong-kang. Endophytic bacterial diversity analysis of huanglongbing Pathogen-Infected citrus phloem tissue in Guangxi[J]. Agricultural Sciences in China，2010，43（23）:4823-4833.

王爱华，殷幼平，熊红利，李颜方，李佳，贤家旭，王中康． 广西柑橘黄龙病植株韧皮部内生细菌多样性分析[J]． 中国农业科学，2010，43（23）: 4823-4833．

[20] MURRAY E A，HOLLIBAUGH T J，ORREGO C. Phylogenetic compositions of bacterioplankton from TWO California estuaries compared by denaturing gradient GEL electrophoresis of 16S RDNA fragments[J]. Applied and Environmental Microbiology，1996，62（7）:2676-2680.

[21] CHENG Xiao-yan，LI Wen-jun，WANG Yun，YANG Hong-mei，LOU Kai. Endophytic bacterial diversity in Glycyrrhiza inflata Bat. from Xinjiang by culture independent method[J]. Acta Microbiologica Sinica，1995，49（6）: 718-725.

程晓燕，李文军，王芸，杨红梅，娄恺． 新疆野生胀果甘草内生细菌多样性的非培养初步分析[J]． 微生物学报，1995，49（6）: 718-725．

[22] CAO Li-xiang，TIAN Xin-li，ZHOU Shi-ning. Isolation of Endophytic Fungi and Actinomycetes from banana （Musa paradisiaca） Plants[J]. Acta Scifntiarum Naturalium Universitatis Sunyaatseni，2003，42（2）: 70-73.

曹理想，田新莉，周世宁． 香蕉内生真菌、放线菌类群分析[J]． 中山大学学报: 自然科学版，2003，42（2）: 70-73．

[23] WOESE C R. Bacterial evolution[J]. Microbiol REV，1987，51（2）: 221-271.

[24] CHEN Bin.Reconstitution of the Cycad-Cyanobacteria association[D]. Fuzhou: Fujian Agrieulture and Forestry University，2004.

陈彬． 蓝细菌与苏铁重组的研究[D]． 福州: 福建农林大学，2004．

[25] ZHENG Si-ping. Diversity of endophytic bacteria within Azolla microphylla[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University，2007.

郑斯平． 小叶满江红内生细菌多样性研究[D]． 福建: 福建农林大学，2007．