低温疗法脱除植物病毒研究进展

摘 要：低温疗法是近几年刚刚兴起的一种新的脱除植物病毒的方法。本文从低温疗法脱除植物病毒的原理、方法、步骤及应用情况等方面进行了综述，旨在为该方法的推广应用提供参考。

关键词：低温疗法；超低温保存；植物病毒；脱毒

中图分类号：S474+.9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）11-0106-06

Research Progress of Cryotherapy on Plant Virus Eradication

Fan JianZhi， Jing ShuiHua， Yang ShuJuan， Duan ChengDing， Huang ChengXing*

（Jining Academy of Agricultural Sciences， Jining 272131， China）

Abstract Cryotherapy is a new plant virus eradication method developed in recent years. In this paper， the cryotherapy principle， methods， procedures and application status were summarized in order to provide reference for further application.

Key words Cryotherapy； Cryopreservation； Plant virus； Virus eradication；

植物病毒是危害农业生产最大的病害之一，有“植物癌症”之称，到目前为止尚未有很有效的防治方法[1]，其中生产和保持无病毒植株材料至关重要[2～4]。传统的植物脱毒方法主要有茎尖培养脱毒法、热处理脱毒法和热处理结合茎尖培养脱毒法等。热处理脱毒法操作容易，但费时，脱毒不完全，植株存活率低；茎尖培养脱毒法脱毒率较高，但需在解剖镜下切取01～05 mm茎尖，操作和培养困难；热处理与茎尖培养相结合的脱毒法比单纯的热处理和茎尖培养的脱毒率和植株成活率高，是目前去除植物病毒较有效的方法[5， 6]。

低温疗法（Cryotheraphy）是近年兴起的一种基于超低温保存（Cryopreservation）新的种苗脱毒方法，可同步实现优良种质资源离体快繁、脱毒和中长期保存目标。其原理是：含有病毒的顶端细胞液泡较大，胞液中含有较多的水分，在超低温（-80℃以下）保存过程中易形成冰晶致死；而增殖速度较快的分生组织胞质浓，含水量少，抗冻性强，液氮保存后可获得无病毒再生植株[7]。目前该项技术已成功用于果树苹果（Malus domestica）潜隐性病毒、李属（Prunus）李痘病毒、香蕉（Musa paradisiaca var sapientum）条斑病毒（BSV）和黄瓜花叶病毒（CMV）、葡萄（Vitis vinifera）病毒GVA、马铃薯（Solanum tuberosum）PSTVd和PVX病毒、草莓（Fragaria ananassa）轻型黄边病毒（SMYEV）等。

低温疗法优点：易于操作，存活率、再生率和脱毒率高，短时间内就可以生产出无病毒植株。低温疗法主要步骤：

准备带病毒植物材料—剥离茎尖—茎尖预处理—组织细胞脱水处理

—液氮处理—茎尖再培养及植株再生—再生植株病毒检测

1 常见的低温疗法研究现状

目前常用于低温疗法的超低温保存方法主要有玻璃化法（Vitrification）、包埋玻璃化法（Encapsulation-vitrification）和微滴玻璃化法（Droplet-vitrification），其中应用最多的是玻璃化法。

11 玻璃化法超低温保存

玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液（Plant Vitrification Solutions，PVS）中，使细胞及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下过冷至玻璃化转变温度（Glassy transition temperature，Tg），从而被固化成玻璃化态（非晶态），并以这种玻璃化态在低温下保存[8]。玻璃化法超低温保存包括以下8个步骤：（1）保存材料适宜类型和状态的筛选；（2）预培养（Preculture）；（3）装载（Loading）；（4）玻璃化溶液脱水（Dehydration with PVS）；（5）投入液氮保存；（6）保存后快速化冻（Rapid warming）；（7）去除玻璃化液（De-vitrification）；（8）保存材料的活性检测和恢复培养（Activity assay and Recovery）。玻璃化法因操作简单快捷，适宜保存种类广泛，保存效果好，是近十年来用于优良种质资源中长期保存的首选方法[9]。

图1 玻璃化法脱毒步骤[9]

与传统的超低温保存方法相比，玻璃化法以其要求设备简单、材料处理步骤简便、省时省力、效果和重复性好等优点备受人们推崇，成为较为理想的植物种质资源保存方法[10]。

Brison 等（ 1997）[11]用超低温保存结合茎尖离体培养，成功地去除了李属根状茎上的李痘病毒，脱毒率达50%（茎尖分生组织培养脱毒率只有20%），开创了超低温脱毒的方法。他们以感染李痘病毒（Plum pox potyvirus，PPV）的樱桃砧木茎尖为试验材料，采用玻璃化法对PPV脱除进行了研究，先将茎尖在富含5% DMSO和2% 脯氨酸的分生组织培养基（MS）上培养24 h，然后转移到改良后的PVS2冷冻保护混合液中20～40 min。冷冻管以1℃/min的冷冻速率冷冻至-40℃，然后浸入到液氮中。第二天，通过快速加温，使样品在40℃融化1min，用含有12 mol/L蔗糖的1/2MS培养基冲洗，并放在分生组织培养基上培养。

Helliot等（2002）[12]通过超低温保存玻璃化法分别除去了香蕉中的黄瓜花叶病毒（CMV）和香蕉条纹病毒（BSV），两种病毒的脱除率分别为30%和90%，而传统的茎尖分生组织培养对CMV和BSV的脱除率仅为0和76%。

王壮伟（2003）[13]用热处理+茎尖培养、热处理+茎尖培养+板蓝根、超低温玻璃化法+茎尖培养3种方法对苹果潜隐性病毒进行了脱除，其中超低温玻璃化法+茎尖培养法脱除苹果病毒效果最好，脱毒率可达70%。

蔡斌华等（2008）[14]用2 mm草莓茎尖为试验材料，通过玻璃化超低温处理脱除了草莓轻型黄边病毒（SMYEV），草莓茎尖的存活率为76%，SMYEV脱除率为95%。

曾继吾等（2009）[15]采用玻璃化法超低温保存技术保存带有BBTV（香蕉束顶病毒）的香蕉茎尖（10～15mm）， 再生后植株BBTV脱除率达606%， 而常规的茎尖培养对BBTV 的脱除率仅为267%。

白建明等（2010）[16]尝试用低温疗法和3种常规方法来去除马铃薯试管苗中的PSTVd（马铃薯纺锤块茎类病毒）和PVX（马铃薯X病毒），结果显示：4 种方法都可以去除PVX，但低温疗法对PVX的去除率最高，为5913%；3种常规方法对PVX的去除率为3583%～5602%。4 种方法都未能有效地去除PSTVd 类病毒，只能通过严格检疫来控制。

王子成等（2011）[17]采用玻璃化法超低温保存对马铃薯病毒PVY（马铃薯Y病毒）和PVS（马铃薯S病毒）进行了脱除研究，结果显示：茎尖（2～3 mm）经过超低温保存后，材料存活率可达716%，比传统的茎尖培养脱毒材料成活率在52%左右高；超低温保存后PVY病毒脱除率达83%，比传统脱毒方法脱毒率（62%）和热处理脱毒率（65%）要高，且操作也较简单；对于马铃薯PVS病毒脱除率在47%左右，而采用茎尖培养病毒的脱除率仅有17%左右。

12 包埋脱水法、包埋玻璃化法超低温保存

包埋脱水法是先将茎尖用藻酸盐溶液包裹，接着在富含蔗糖的培养基上预培养，再用无菌空气流或干燥硅胶干燥，然后投入液氮保存。超低温保存的茎尖用快冻法或慢冻法化冻后，接着放在再培养基中进行恢复培养和植株再生[18～21]。因为外植体的高度干燥，细胞内多数或者全部的自由水都能够被移除，而且在液氮中快速冷冻，内部溶液就会发生玻璃化，因此避免了细胞内冰晶的形成[21，22]。

相对玻璃化法而言，包埋脱水法的优点在于避免使用二甲亚砜和乙二醇等对细胞有毒性的冰冻保护剂；其次降温过程也比较随意，保存的样品体积也可以比较大。但是，用包埋脱水法保存组织恢复生长慢，脱水所需时间长，而且在一些植物中存活率、成苗率低[23]。

包埋玻璃化法是Tannoury（1991）在超低温保存康乃馨茎尖时形成的一种用藻酸盐包裹和PVS2玻璃化溶液结合的方法[24]。先用藻酸盐将茎尖包裹成球，然后将其放在富含蔗糖的培养基上预培养，用渗透保护溶液装载，接着用玻璃化溶液脱水，再直接投入液氮。化冻后，超低温保存的茎尖用卸载溶液处理除去玻璃化溶液，然后对茎尖进行恢复培养，获得再生植株[9，25]。

包埋玻璃化法对材料的玻璃化处理时间范围要求较宽，且包埋球能降低玻璃化液对茎尖的伤害。因此，包埋玻璃化法比玻璃化法操作更方便，并可同批次处理大量材料[26]。

Wang 等（2003）[27]利用玻璃化法和包埋脱水法脱除了葡萄中的葡萄病毒A（GVA），均获得了97%的无病毒植株，而单一的分生组织培养脱毒率仅为12%。而且超低温保存的茎尖大小在05～20 mm之间时，病毒的脱除率不受茎尖大小的影响。Wang 等（2006）[18]又用包埋玻璃化法、包埋脱水法进行了脱除马铃薯PLRV（马铃薯卷叶病毒）和PVY病毒的研究，均获得了无病毒植株。其中包埋玻璃化法对两种病毒的脱除率分别为83%和93%，包埋脱水法对两种病毒的脱除率分别为85%和91%。

Wang 等（2008）[28]又对05～15 mm 大小（含有2～4个叶原基）的甘薯茎尖进行了包埋玻璃化法超低温保存处理， 结果所有再生的材料均脱除了甘薯黄萎病毒（sweet potato chlorotic stunt virus， SPCSV）和甘薯羽状斑点病毒（sweet potato feathery mottle virus， SPFMV）， 而单一的茎尖培养仅能够脱除SPCSV，SPFMV的脱除率仅为7%～10%。同时，又采用热疗法和包埋玻璃化法相结合的方法对覆盆子木霉病毒RBDV（raspberry bushy dwarf virus，）进行了脱除研究，所用茎尖大小1 mm，病毒脱除率为33%～35%。该病毒可以通过授粉进行传播，且传统的茎尖培养不能将其脱除[29]。

13 微滴玻璃化法超低温保存

微滴法是在超低温保存木薯（ Manihot esculenta）的茎尖分生组织过程中首先创造出来的。方法是先把低温保护剂滴到铝箔条上形成2～3 μl的微滴，然后把待保存材料放置到微滴之中，把铝箔连同微滴一起送入程序降温仪的冷冻室，按一定的速度降温到-20～40℃，然后投入液氮中。因为表面张力的作用，操作过程中微滴并不会从铝箔条上滑落。该方法的主要优点是使用极少量的低温保护剂，并利用铝箔良好的导热性能，以提高待保存材料降/升温的均匀一致，减少因为材料降温速度不均匀而造成的伤害[30]。

微滴玻璃化法是结合了玻璃化法和微滴法的技术，茎尖先用渗透剂预培养，用装载溶液装载，用PVS2脱水，然后单个放到铝箔片上的玻璃化溶液微滴中（4～15 μl PVS2），再投入液氮快速冷冻，接着将超低温保存的茎尖立即化冻，并放在富含蔗糖的液体培养基中卸载。然后放在培养基中进行恢复培养和植株再生[9，19， 20， 25]。

Wang 等（2006）[18]用微滴玻璃化法脱除马铃薯PLRV和PVY病毒，两种病毒的脱除率分别为86%和95%。

2 低温疗法脱除病毒的细胞学机制

为了弄清楚超低温保存脱除病毒的机制，Helliot等（2002）[12]用光学显微镜对比观察了香蕉茎尖分生组织（对照）和超低温保存后快速增殖的分生组织结构，发现超低温保存方法仅允许位于分生组织顶端和叶原基基部小区域的细胞存活。植物茎尖细胞组成是异质性的， 其中包括有分化的细胞和未分化的细胞。在超低温保存过程中， 分化的成熟细胞由于液泡较大并且含水量较多， 在超低温处理时不容易脱水， 因而易被形成的冰晶破坏致死；而未分化的细胞由于液泡较小或不含液泡， 所以含水量少、胞质浓， 在超低温保存后易于成活[31]。这些小区域存活的细胞保持着活跃的细胞分裂和组织结构，从而导致再生出完整植株。被损坏的细胞位置表明冷冻损伤一般是和增多的液泡有关。实际上，冰冻损伤主要是由于细胞内水结晶的结果，而这种水结晶发生在冷处理或者是热处理步骤当中。因此，在冷冻疗法和分生组织培养之间主要的区别在于存活的分生组织细胞层的数量[12]。

对于感染病毒的植物， 其未分化的分生组织细胞一般不含病毒[31]。Wang（2008）将Karyeija等的组织化学的免疫定位法用于脱除甘薯SPFMV和SPCSV的研究中。在单一感染SPFMV和复合感染SPFMV和SPCSV的植物体中，SPFMV在第5和第4叶原基中被发现，在第1、2、3叶原基和生长点中没有被发现。然而，在单一感染SPCSV和复合感染SPFMV 和 SPCSV的植物体中，SPCSV仅在第5叶原基中观察到，而在第1～4叶原基和生长点中均未发现[28，32]。

在分生组织穹顶和最原始的1、2叶原基中的细胞尺寸是小的，含有小的液泡和高的核质比率[28，29]。相比而言，分生组织基部和3、4叶原基的细胞较大，含有大的液泡和小的核质比率。这些结果和在芭蕉（属）茎尖上的研究结果一致[33]。经过低温疗法后，存活的细胞仅在生长点和最原始的1、2原基中观察到，在生长点基部的部分细胞、第3叶原基和其它较老组织的细胞均被杀死。这种存活模式已经在各种各样的植物种类中观察到，比如香蕉（Musa spp）[12，33，34]，巧克力秋英（巧克力波斯菊，Cosmos atrosanguineus）[34]，覆盆子（Rubus idaeus）[36]和马铃薯（Solanum tuberosum）[36]。

由于植物体内的病毒分布不均匀[37]，被感染的茎尖经受低温疗法后，通过液氮冷冻，在生长点基部的部分细胞，和更多发达的叶原基被杀死，这些细胞通常被植物病原菌感染，尤其是病毒。相比之下，在生长点上部的细胞和最原始的1、2叶原基在经受冷冻后存活，这些细胞没有或者含有非常少量的病原菌[38]。随后，经受冷冻疗法之后的再生植株则是不含病原菌的[11，12， 28，29 ]。因而低温疗法可以将含有病毒的细胞冻死， 而保留不含病毒的细胞，再生材料即可脱除病毒[39]。

3 小结和展望

和传统的分生组织培养相比，茎尖低温疗法可以高频率的获得无病原菌植株，而且避免了非常小的茎尖剥离和植株再生的困难。低温疗法作为一种新的脱除植物病毒的方法，已成功用于多种植物多种病毒的脱除，这些研究为一些极难脱除病毒的植物提供了一条可行途径。但是该技术是超低温保存方面研究的较新领域，相对于其它脱毒技术，其发展历史还很短，相关研究还不多。因此，还需进一步优化低温疗法，拓展适宜脱毒的植物种类，提高脱毒效果。相信随着研究的深入进行和技术的进步，低温疗法应用于植物脱除病毒的研究将会越来越广泛。参 考 文 献：

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