红霉素对支气管哮喘儿童Th1/Th2细胞及T淋巴细胞凋亡的调控研究

【摘要】目的 探讨红霉素对支气管哮喘儿童TH1/TH2细胞及T淋巴细胞凋亡的调控。 方法 按哮喘诊断标准选取哮喘患儿74例，入选后留取血液标本，设为对照组，之后给予红霉素口服，共30天，留取血液标本，设为治疗组，采用荧光单细胞内染色法检测经红霉素治疗前后Th1/Th2细胞活性变化，用双抗体夹心ABC-ELISA法检测治疗前后血清sFas、sFasL水平，用吖啶橙-溴化乙锭染色法检测治疗前后T淋巴细胞凋亡率，结果与对照组比较，并用统计学分析。 结果 治疗组Th1、Th1/Th2较对照组显著下降（p

【关键词】 红霉素；支气管哮喘；Th1/Th2；细胞凋亡；调控

【Abstract】Objective： To investigate the effects of erythromycin on the regulation of the Th1/Th2 cells and T lymphocyte apoptosis in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs） of bronchial asthmatic children. Methods： Seventy-four cases were included according to the diagnostic criteria of asthma children. peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）before and after erythromycin treatment for thirty days were isolated from venous blood. Levels of Th1，Th1/Th2 of PBMCs were determined by single-cell fluorescence staining method； Levels of sFas and sFasL in serum of asthmatic children before and after the treatment was examined with sandwich ELISA methods； Rates of T lymphocyte apoptosis incubated for 0h and 48h before and after the treatment were detected with acridone acetamiprid orange-brominated b ingot dyeing method. Statistical analysis was performed. Results： After erythromycin treatment， the levels of Th1，Th1/Th2 were significantly decreased than before treatment（p

【中图分类号】R725.6 【文献标识码】A【文章编号】1672-3783（2014）01-0277-01 支气管哮喘是一种严重威胁儿童健康的慢性呼吸系统疾病，其发病率与死亡率的逐年增高与患儿的过敏体质导致的易感性密切相关。自20世纪90年代以来，与T淋巴细胞相关的哮喘免疫学发病机制受到了广泛重视，其研究已达分子水平。随着现代分子生物学的不断发展，已证实体液中多种细胞因子、免疫活性物质及炎性介质均以不同形式参与了哮喘的发病。现将红霉素对支气管哮喘儿童Th1/Th2细胞及T淋巴细胞凋亡调控的研究，报道如下。

资料与方法

1.临床资料：按照2003年中华医学会呼吸学组制定的哮喘诊断标准[1]，于门诊随机选取哮喘患儿74例，男性43例，女性31例，年龄最大11岁，最小3岁，平均年龄6.21岁；入选儿童哮喘严重程度为轻度间歇至中度持续、未应用全身免疫调节剂且最近2月未应用激素类（包括吸入激素）和大环内酯类药物，实验期间未出现哮喘急性发作病例。

2.方法：哮喘儿童入选后（对照组），于次日清晨采集肘静脉血5ml，加无菌肝素1.5mg/ml，混匀后分离细胞成分，血浆存于-70℃冰箱备测，该操作严格按说明进行；治疗组给予口服红霉素6mg/kg/d，分3次口服，最大量不超过750 mg/d，共30天，治疗后留取血液标本，方法同对照组。

2.1 采用荧光单细胞内染色法检测Th1/Th2活性：抽取肝素抗凝血2-3ml，用含5%小牛血清的PBS（自配）按1：1稀释。用淋巴细胞分离液（自配），将稀释的抗凝血进行淋巴细胞分离，调整细胞浓度至106/ml悬液。取细胞悬液100μl加入相应抗体，检测Th1/Th2活性。

2.2 采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测sFas/sFasL水平：用抗人Fas/Apo-1（或FasL）单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的Fas/Apo-1（或FasL）与单抗结合，加入生物素化的抗人Fas/Apo-1（或FasL）抗体，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，Fas/Apo-1（或FasL）浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中Fas/Apo-1（或FasL）浓度。

2.3 采用吖啶橙-溴化乙锭染色法分别检测培养0、48小时检测T淋巴细胞凋亡率：取淋巴细胞悬液25ul加2ul染液（吖啶橙100ug/ml，溴化乙锭100ug/ml，用PBS配制混匀）静止10分钟，取10ul于玻片上，荧光镜观察淋巴细胞，呈现核固缩，沿核膜点块状、新月状或杆状改变者为凋亡细胞，计数200个细胞并计算出凋亡细胞百分率。

3.统计学处理方法：采用SPSS12.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±S）表示，两均数比较采用t检验，P

结果

1.治疗与对照组Th1、Th2及Th1/Th2检测结果，见表1。

2.治疗组与对照组T淋巴细胞凋亡率检测结果，见表2。 培养0小时及48小时两组比较，哮喘组均明显高于对照组，差异有显著统计学意义（P

3.治疗组与对照组血清sFas、sFasL检测结果，见表3。 治疗组均明显高于对照组，差异有显著统计学意义（P

讨论

任何类型的哮喘病的基本病理变化都是一种气道炎症性改变，这种非特异的气道炎症是引起患儿气道高反应性、通气功能障碍及临床症状的关键因素，研究证实，哮喘患儿存在免疫功能紊乱，淋巴细胞及其分泌的各种细胞因子发挥了重要作用。

1.红霉素对哮喘患儿Thl/Th2细胞的调控

支气管哮喘免疫功能异常主要表现是T细胞亚群功能紊乱[2]。胸腺中的成熟T细胞迁移至外周，经抗原刺激成为效应T细胞，依据所分泌因子的不同，进一步分为Th1（主要分泌IL-2、r-IFN）和Th2细胞（主要分泌IL-4、5、6、10、13），各种因子发挥着不同的生物学效应。在哮喘患者，体内Th1细胞普遍减少，细胞功能低下，r-IFN生成少，对IL-4及IgE生成的抑制作用减弱；Th2细胞分泌的IL-4可以抑制Th1分泌r-IFN，并在IL-5、IL-6的协同下诱导和促进B细胞表达IgE，形成IL-4/r-IFN比例失衡，体内IgE的合成增加，从而介导速相变态反应的发生[1]，因此Th1/Th2失衡是哮喘病发生的关键机制。以红霉素为代表的大环内酯类药物近年来已被证实具有免疫调节作用，能够抑制多种细胞因子的表达和炎症反应：1997年Takizawa等的研究表明红霉素可抑制支气管上皮细胞IL-6、IL-8的表达[3]；2000年Etsuro Sato等研究发现红霉素能显著削弱嗜酸性粒细胞趋化因子的活性。国内胡庆东等报道红霉素可明显下调哮喘患儿PBMC中IL-2、IL-6的表达；吴岚等研究红霉素衍生物对单核细胞的增生增殖的抑制；薛玉文等报道红霉素可抑制哮喘患者肺泡巨噬细胞分泌TNF-a、IL-8起抗炎作用[4]；肖伟等报道红霉素可明显下调支气管哮喘患者的IL-4和IL-6的mRNA表达，对IL-2有一定的抑制，支气管哮喘患者PBMC经红霉素作用后，其Th1/Th2类因子表达的偏移状态被逆转。

本次研究结果显示治疗组Th1、Th1/ Th2明显高于对照组，而Th2则明显降低，差异均有统计学意义，该结果证实了红霉素对Th1/Th2及因子的偏移有逆转作用。

2.红霉素对哮喘患儿T淋巴细胞凋亡的调控

细胞凋亡的概念首先于1972年由Kerr等三位科学家提出，是细胞在多种酶参与下发生死亡的一个过程，该过程受多种基因的调控。人的Fas主要在外周血CD4+、CD8+、B细胞、少数NK细胞、骨髓细胞系和部分组织上表达。FasL主要在激活的T淋巴细胞和B淋巴细胞上表达，二者均属于肿瘤坏死因子超家族成员，以膜结合（mFas、mFasl）和可溶型（sFas、sFasl）两种形式存在，Fas和FasL结合可以诱发T细胞凋亡，Fas介导的细胞凋亡是Th1/Th2失衡的重要原因[5]。研究显示，Fas介导的淋巴细胞凋亡可使IL-10产生增多，Fasl+的细胞可以使免疫应答向Th2方向偏移[6]；Fas的表达与Th1细胞凋亡率呈正相关，与Th2细胞凋亡率呈负相关[7]。有学者报道，在哮喘患者Fas/Fasl信号介导的免疫耐受缺陷导致CD4+T细胞活化、增殖，诱导Th1细胞凋亡、增强Th2型免疫反应，造成Th1/Th2失衡、免疫功能发生紊乱[8]。

本组实验显示，治疗组患儿T淋巴细胞凋亡率明显低于对照组，说明红霉素对哮喘患儿的T淋巴细胞的凋亡具有着显著的调节作用，其机制可能是通过降低Fas介导的Th1的凋亡率而促使Th细胞的极化回复平衡。

参考文献

[1]中华医学会儿科学会呼吸组.儿童支气管哮喘防治常规[J].中华儿科杂志，2004，42（2）：100-104.

[2]杨运刚，陈茂荣.T淋巴细胞在儿童支气管哮喘发生中的作用[J].实用儿科临床杂志，2003，18（8）：615-616.

[3]Takizawa H，Desali M，Ohtoshi T，et al.Erythromycin supperlesses interleukin-6 expression by human brochial epithehal cells：a potential mechanism of its anti-inflammatory action[J].Biochem biophys Res Commun，1995，210（3）：781

[4]薛玉文，王玲，李玉.红霉素对哮喘患者肺泡巨噬细胞介质释放功能的影响[J].天津医药。1999，27（2）：70-71

[5]冯金环，殷学红，秦璞.红霉素对支气管哮喘患儿血清Fas、sFasl的影响[J].中国医师进修杂志.2011，34（28）：53-54

[6]Daigle I，Ruckert B，Schnetzler G，et al.Induction of the IL-10 gene via the fas receptor in monocytes-an anti-inflammatory mechanism in the absence of apoptosis.Eur J Immunol，2000，30；2991-2997

[7]曹雪涛.免疫学前沿进展[J].人民卫生出版社，2009： 233-235.

[8]杨平满 王悦虹 周建英.Fas/Fasl与支气管哮喘[J].中华哮喘杂志：（电子版） 2011，5（5）：367-370

作者简介：于磊（1982-），男，硕士研究生，医师，研究方向：小儿呼吸系统疾病。王欢欢（1988-），女，护士，宁夏石嘴山市中心医院。 通讯作者：秦璞（1953-），女，青岛海慈医院党委书记。