柔红霉素对K562细胞凋亡及FAKmRNA影响的研究

【摘要】目的研究柔红霉素诱导K562细胞增殖和凋亡情况，以及调节细胞周期和FAKmRNA基因，进一步探讨通过调控FAK表达，研究抗白血病的作用机制。方法应用CCK8细胞增殖法，结合流式细胞仪检测法检测不同浓度柔红霉素在不同时间对K562细胞增殖和凋亡的影响， 应用RTPCR和Western blot技术检测不同浓度柔红霉素作用对K562细胞FAKmRNA以及蛋白表达水平的变化。结果K562细胞的增殖抑制率随着柔红霉素浓度增加及作用时间延长逐渐升高，同一浓度不同时间组之间，或者同一时间不同浓度组之间比较，差异均有统计学意义（P

【关键词】

白血病；K562细胞；柔红霉素；细胞增殖；凋亡；FAKmRNA

从20世纪70年代开始，蒽环类抗生素作为治疗白血病关键药物之一应用于临床，其中柔红霉素（daunorubicin，DNR）是白血病化疗的主要药物[1]。对柔红霉素（DNR）治疗作用的研究，以前仅停留在它与肿瘤细胞DNA分子的相互作用及其在体内的代谢阶段，而具体的作用机制尚不清楚。粘着斑激酶（focal adhesion kinase，pp125FAK）是一种细胞内非受体型酪氨酸激酶，在丝氨酸转化细胞的磷酸化蛋白中发现，与酪氨酸激酶2（proline rich tyrosine kinase2，PYK2）及细胞粘附激酶β（cellular adhesion kinaseβ，CAKβ）组成 FAK家族[2]。FAK在正常细胞的生长周期，增殖分化，迁移运动及血管生成等过程均发挥主要作用，并且，FAK在多种肿瘤细胞中高表达，在肿瘤细胞激活过程及侵袭转移中也起关键作用，并已逐渐成为肿瘤治疗的新靶点[3]。本实验利用一定浓度的柔红霉素体外作用于K562细胞，研究其对K562细胞的增殖和凋亡，FAKmRNA表达以及FAK蛋白的影响，进一步探讨通过调控FAK表达，研究抗白血病的作用机制。

1材料和方法

1.1试剂和细胞系人慢性粒细胞白血病急变期K562细胞，由孙逸仙纪念医院医学研究中心馈赠，柔红霉素购于深圳万乐制药厂，胎牛血清和RPMI1640培养基购于美国Gibco公司，碘化丙锭（PI）购于北京中山生物工程公司，Annexin2V/PI试剂盒购于北京宝赛生物工程公司。CCK8购于上海同仁公司，RTPCR试剂盒，RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司。fakmRNA引物和内参NADPH购于上海英俊生物工程公司。

1.2细胞培养K562细胞培养于含有10%的胎牛血清的RPMI1640培养基中，在含5%CO2饱和湿度的培养箱中常规传代培养。每2 d换液1次，取对数生长期细胞用于各项实验。

1.3测定方法

1.3.1柔红霉素对K562细胞增殖影响的CCK8法检测

将2×10.4/ml细胞悬液接种于96孔板，每孔200ul，分别设阴性对照组和空白对照组，实验组分别立刻加入终浓度为0.15，0.3，0.6，1.2，2.4 mg/L的柔红霉素，每孔设4个复孔，培养36 h后往每孔中加入10 μlCCK8溶液，37℃温育2 h后，上酶标仪测各孔A595值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：

增殖抑制率=（1实验孔平均OD值/对照孔平均OD值）×100%

1.3.2柔红霉素对K562细胞凋亡的FCM检测

采用Annexin2V/PI双染法FCM检测，方法参照试剂盒说明书进行，调整K562细胞浓度至2×10.5/ml，接种于6孔的培养板，每孔加入2 ml细胞液，立刻加入终浓度为0，0.15，以及0.3 mg/L的柔红霉素，置于培养箱培养36 h，分别收集细胞于离心管中用冷PBS洗涤离心2次，弃PBS，加100 μlbinding buffer，重悬细胞，然后加入Annexin2V 5 μll和PI 2 μl，4℃避光30 min，再加400 μlbinding buffer，上流式细胞仪检测。

1.3.3柔红霉素对K562细胞周期影响的流式细胞仪检测

调整K562细胞浓度至（5～10）×10.5/ml，接种于6孔的培养板，每孔加入2 ml细胞液，于培养箱24 h后分别加入柔红霉素的终浓度为0，0.15，以及0.3 mg/L，与培养箱培养36 h，分别收集细胞于离心管中用冷PBS洗涤离心2次，弃PBS，用70%冰乙醇固定过夜后加入PI染液0.6 ml，避光染色半小时，上流式细胞仪检测。打印DNA含量直方图，自动拟合细胞周期各时相比例，重复实验5次。