大长径比金纳米棒的合成及其单细胞毒性研究

摘 要 利用三步晶种生长法合成长径比约为14的大长径比金纳米棒（GNR），利用巯基十一酸（MUDA）对金纳米棒表面进行了生物适应性修饰，并在宏观水平上研究了修饰前后的金纳米棒在对细胞活性的影响。利用单细胞方法分别考察了修饰后的纳米金棒对细胞贴壁过程、增殖速率、细胞内ROS以及骨架排布的影响。虽然MTT细胞活性结果显示内吞后的金纳米棒对细胞无毒，但单细胞毒性分析方法发现，不同浓度纳米金棒对早期贴壁过程有较小的影响，且内吞的纳米金棒在一定程度上促进了细胞的增殖，而高浓度下纳米金棒引起了细胞内ROS含量的升高，并破坏了细胞内骨架纤维排布。本研究建立了用单细胞行为分析纳米颗粒对细胞毒性的方法，证明了以往仅仅利用MTT等宏观手段分析纳米材料生物适应性是不足的。纳米材料在生物医学领域的进一步应用还应考虑单细胞及分子水平上的毒性效应。

关键词 大长径比金纳米棒； 表面修饰； 细胞毒性

1 引 言

金纳米棒是一种棒状的金纳米颗粒，特殊的形状使其具有更为奇特的性质，金纳米棒的纵向等离子共振峰会随着长径比的增大向近红外区移动。由于可见光不容易穿透生物组织，而大长径比的金纳米棒在近红外光区对光的吸收和散射能力都很强，因此对于皮下组织的癌症治疗和诊断具有更好的选择性[1，2]。

金纳米棒在生物体的广泛应用，使得研究不同物理和化学性质的金纳米棒对细胞的影响变得十分重要[3]。尤其是金纳米棒的表面化学对其生物行为的影响[4]。对不同种类纳米颗粒的研究表明，纳米颗粒的表面化学强烈影响它的细胞毒性和细胞内吞[5～10]。金纳米棒合成过程需要用十六烷基溴化铵（CTAB）作为金纳米棒生长的保护剂和软模板，但CTAB显示出了严重的细胞毒性[10～12]。为了降低金纳米棒的毒性效应，许多对其表面修饰的方法应运而生，例如利用聚合物[10]和磷脂[13]包裹表面带CTAB的金纳米棒，或是用其它分子如HS-PEG来置换金纳米棒表面的CTAB分子[6]。

通常，评估金纳米棒毒性的主要方法是对细胞的活性进行表征，采用的方法都是宏观测量的平均结果，如MTT细胞活性测量法等。这些方法一般取的都是长时间培养后大量纳米棒对很多细胞的平均毒性。而近年的研究发现，这种平均测量结果已经无法很好地反映纳米材料的生物适应性。金纳米棒暴露于细胞后不仅只对细胞的增殖和内吞产生影响[14]，长时间的暴露还可能会引发细胞内氧化压力的变化，可能会导致细胞凋亡或其它复杂的细胞反应[15，16]。这就需要在单细胞水平上实时原位研究金纳米棒与细胞的相互作用。目前，单细胞水平上表征细胞活性的方法主要以染色为主。在纳米材料被细胞内吞进入细胞之后所引起的细胞各个功能的影响都有相对应单细胞分析方法。当体外粘附培养的细胞传代之后，具有一定的贴壁周期，通过考察内吞有纳米材料的细胞传代后细胞贴壁面积以及细胞伸展形态随贴壁时间的变化可以考察纳米材料对贴壁的影响。接着，通过统计细胞数量随细胞增殖时间的变化，可以考察细胞增殖速率。再者，内吞纳米材料之后，对细胞内分子的调节和影响也有方法可以进行单细胞分析，如细胞内氧化压力（ROS）水平，可以通过对应的ROS染料（DCFH-DA）进行表征，荧光越强，表示ROS水平越高。纳米材料进入细胞后对细胞骨架的调节也可通过对骨架识别的染料（Phalloidin-FITC）进行分析。

本研究先合成长径比约为14的大长径比金纳米棒，利用巯基十一酸（MUDA）对金纳米棒表面进行修饰。在宏观水平上，采用MTT细胞活性表征法研究了GNR-MUDA对细胞的毒性；在单细胞水平上，分析了GNR-MUDA对细胞贴壁周期、增殖速率、细胞内ROS以及细胞骨架排布的影响。这些单细胞分析方法可以被推广用于研究其它纳米粒子的生物适应性。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

85-Z型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；DK-S22恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；DGX-9143BC-1电热鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；Centrifuge 5415D型离心机（Eppendorf公司）；超净工作台；CO2培养箱（Thermo公司）；CKX 41相差显微镜（日本Olympus公司）；CRX6型干热灭菌箱（上海精宏实验设备有限公司）；Malvern Zetasizer Nano仪；JEOL-1230型透射电子显微镜；酶标仪；低温离心机； Nikon Eclipse 80i正置显微镜；Nikon 60 ×（NA 0.7-1.25）镜头；Olympus DP72彩色CCD摄像机；超声波清洗仪（宁波新芝生物科技有限公司）。

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，99%）， HAuCl4·3H2O（99.99%）， NaBH4（98%）， 抗坏血酸（AA，99.7%）， 浓HCl（38%）， 浓HNO3（分析纯），均购自上海国药集团化学试剂有限公司； 胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、细胞基础培养基（Dulbecco's mdification of eagle's medium，DMEM）、磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.4）、抗生素（Penicillin-streptomycin）、胰蛋白酶Typsin-EDTA（0.05%，0.25%）， 均购自美国GIBCO公司；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、70%酒精， 均购自北京鼎国生物科技有限公司。巯基十一酸（MUDA）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、鬼笔环肽（Phalloidin-FITC）、2′，7′-二氯氢化荧光素（2′，7′-dichlorodihydrofluorescin diacetate，DCFH-DA）， 均购自美国Sigma公司。实验用水均由Millipore公司的超纯水装置（TANKPE030）制备的二次蒸馏水。