北豆根蝙蝠葛碱含量的测定方法

摘要:采用酸性染料比色法测定北豆根提取物中北豆根总碱(TAMD)的含量,采用高效液相色谱(HPLC)法测定蝙蝠葛碱(Dayrucube)的含量的方法灵敏、准确、重现性好,可作为北豆根提取物中TAMD和蝙蝠葛碱的含量分析方法。

关键词:北豆根;含量;测定;技术

中图分类号:TQ461 文献标识码:A文章编号:1007-9599 (2010) 01-0000-02

北豆根为防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauricum DC.的干燥根茎,其有效部位是生物碱。现已知北豆根中含有近20种生物碱,总碱含量可达1%以上,其中含量最高的生物碱为蝙蝠葛碱,其含量约占总生物碱的50%左右。北豆根总碱(TAMD)对呼吸道致病菌有抑菌作用,尤其对肺炎球菌效果更为显著。其制剂北豆根片可治疗急性咽炎、扁桃体炎,经过多年的临床应用已收入2005版《中国药典》。2005版《中国药典》用酸碱滴定法控制含量,终点不易判断,误差大。本实验采用酸性染料比色法测定提取物中TAMD从而用这两个指标控制提取物的质量。

一、器材

HP-8453紫外-可见分光光度计;AG-254型电子分析天平(瑞士梅特勒);WT-02型电热恒温干燥箱(北京恒星医疗器械厂);ZFQ-85A型旋转蒸发仪(上海医械专机厂);R2002型旋转蒸发仪(上海申顺科技公司);JASCO高效液相色谱仪(UV-15紫外-可见检测器,RU-1580泵,CKCHOM色谱工作站,日本);北豆根饮片(市售,承德产,经鉴定为蝙蝠葛);北豆根碱(对照品,自制,含量99.0%);95%乙醇、氨水、硫酸、三氯甲烷、无水甲醇、磷酸、酚酞为分析纯;甲醇、乙腈为色谱纯。

二、方法与结果

(一)酸性染料比色法测定提取物中TAMD的含量

1.比色原理不吸收可见光的无色物质通过络合、氧化还原等反应生成有色物质,可用于比色测定。实验证明,溴甲酚绿在无水甲醇(pH=6)中,可与TAMD直接络合生成绿色化合物,用于比色测定。

2.最大吸收波长的选择精密称取蝙蝠葛碱对照品(60℃干燥至恒重)10.0mg置50ml容量瓶中,加无水甲醇溶解,最后用无水甲醇定容至50ml,作为对照品溶液。

精密吸取对照品溶液1.0ml置10ml容量瓶中,加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2ml,用无水甲醇定容,在200～700nm进行扫描,选择最大吸收波长,确定最大吸收波长为620nm。

3.显色剂用量的考察分别精密吸取0.1%溴甲酚绿溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9ml置10ml容量瓶中,再分别加入对照品溶液1.0ml,用无水甲醇定容,在620nm处测定吸收度。

结果表明,显色剂用量为0.2ml时吸收度最大,故选用显色剂用量为0.2ml。

4.显色稳定性的考察以加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2ml的样品为考察对象,在120min内于620nm处测定吸收度,随行试剂空白。

平均吸收度为0.423,RSD为0.03%,表明吸收度在120min内没有明显变化。

5.标准曲线的制备分别精密吸取对照品溶液0.3,0.5,0.8,1.0,1.2,1.5,2.0ml,置10ml容量瓶中,加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2ml,于620nm测定吸收度,随行试剂空白。以蝙蝠葛碱浓度C对吸收度A进行线性回归,得标准曲线方程:C=49.91A-0.88,r=0.9998(n=7),线性范围为6～40μg•ml-1。

6.精密度实验取2.1.5中的样品(20μg•ml-1)测定吸收度,重复测定5次,平均吸收度为0.423,RSD为0.11%。

7.加样回收率实验精密称取北豆根提取物2.0mg(总碱含量以北豆根碱计为92.7%),置10ml容量瓶中,加无水甲醇使溶解,超声提取15min,用无水甲醇定容至10ml,总碱浓度以蝙蝠葛碱计0.185mg•ml-1。蝙蝠葛碱对照品溶液浓度为0.2mg•ml-1。分别精密吸取两种溶液各0.4,0.5,0.6,0.8,1.0ml,一一对应混合于10ml容量瓶中,无水甲醇定容。

(二)含量测定

1.北豆根药材的处理饮片粉碎过40目筛,60℃干燥。称取1.0g置索氏提取器中,加入氯仿30ml,氨水1.0ml,浸泡24h。再加入氯仿50ml,80℃水浴回流3h,水浴蒸干氯仿。残渣用无水甲醇溶解,溶液转移置50ml容量瓶中,无水甲醇定容,作为备试溶液。

2.北豆根提取物的处理精密称取北豆根提取物(60℃干燥至恒重)2.0mg置10ml容量瓶中,加无水甲醇溶解,过滤,洗涤容器及滤器3次,合并滤液及洗液,用无水甲醇定容至10ml备用。

3.北豆根药材中TAMD的测定取备试溶液1.0ml置10ml容量瓶中,加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2ml,用无水甲醇定容,于620nm测定吸收度,随行试剂空白。根据回归方程计算TAMD含量。经测定,本实验所选用的北豆根药材中TAMD含量为1.23%。

4.北豆根药材中蝙蝠葛碱的测定取备试溶液3.0ml置10ml容量瓶中,挥干甲醇,加入流动相适量,振摇使溶解后用流动相定容。照色谱条件测定峰面积。根据回归方程计算蝙蝠葛碱含量。经测定,本实验所选用的北豆根药材中蝙蝠葛碱的含量占TAMD的45.76%。

5.北豆根提取物中TAMD的测定取备试溶液0.5ml置10ml容量瓶中加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2ml,用无水甲醇定容,于620nm测定吸收度,随行试剂空白。根据回归方程计算TAMD含量。经测定,本实验所得到的北豆根提取物中TAMD含量为92.71%。

6.北豆根提取物中蝙蝠葛碱的测定取备试溶液2.0ml置10ml容量瓶中(浓度为4%),挥干甲醇,加入流动相适量,振摇使溶解后用流动相定容。照色谱条件测定峰面积。根据回归方程计算蝙蝠葛碱含量。经测定,本实验所得到的北豆根提取物中蝙蝠葛碱的含量占TAMD的48.06%。

三、讨论

中药质量标准的研究一直是中药现代化研究中的重要组成部分。由于中药成分复杂或有效成分不明确,有些直接以原药材或粗提物入药,使得很多中药的含量测定成为难点。近年来,一些现代化技术的应用推动了中药有效成分的提取、分离和含量测定的研究。《中国药典》2005版收录的北豆根片中只规定了TAMD的含量测定,方法为酸碱滴定法。由于各地北豆根药材中,TAMD的组成有差别,只控制TAMD的含量尚不能全面反映制剂所需的原料和成品的质量。本实验测定了单体蝙蝠葛碱在总碱中的含量,进一步完善了提取物和制剂的质量标准。酸碱滴定法操作复杂,终点不易判定,误差大。本实验采用酸性染料比色法测定TAMD含量、采用高效液相色谱法测定蝙蝠葛碱含量,操作简单,方法专属性强,灵敏度高。

参考文献:

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