oxHDL3对人脐静脉内皮细胞t―PAmRNA表达的影响

摘要：目的 探讨oxHDL3对人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12细胞组织型纤溶酶原激活物（tissue type plasminogen activator，t-PA）表达的影响。方法 HUVEC-12细胞分别经不同浓度（0、20、40、80 mg/L）HDL3、oxHDL3孵育，采用RT-PCR的方法检测t-PAmRNA表达情况。结果 与0mg/L oxHDL3组比较，oxHDL3呈剂量依赖性下调t-PA mRNA的表达，以80 mg/L oxHDL3浓度组减少最明显，较0mg/LoxHDL3组下降了30%（P

关键词：t-PA；HDL3；oxHDL3；动脉粥样硬化

中图分类号：R183.4 文献标志码：A

动脉粥样硬化病变发生的原因和发病机制一直是医学领域内的重要研究课题。已有的证据表明，动脉粥样硬化与脂蛋白代谢密切相关。Nakajima等在人腹主动脉粥样硬化斑块内膜处用oxHDL 特异抗体9F5-3a检测到oxHDL的存在，并定位在主动脉内皮细胞，清道夫受体SR-B1 和 LOX-1是其受体[1]。最近有文献证实，oxHDL及亚型oxHDL2、oxHDL3通过激活p38MAPK上调TF的表达[2]，此外，oxHDL及其亚型还可通过减少内皮细胞TFPI-1分泌[3]，减弱对TF的抑制作用，干扰体内抗凝/促凝平衡，从而促进As血栓的形成。这提示oxHDL在As发生发展中起重要作用。本文通过观察oxHDL3对人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12细胞表达t-PA mRNA的影响，为阐明oxHDL在动脉粥样硬化发生发展过程中的作用提供新的实验依据。

1资料与方法

1.1一般资料 HUVEC-12细胞株来源于中南大学湘雅医学院细胞中心，RPMI-1640培养基为Gibco产品；谷氨酰胺、丙酮酸钠、胰蛋白酶和EDTA为Sigma产品；胎牛血清为杭州四季清产品。通用RT-PCR试剂盒购自北京博大泰克生物公司。健康人血浆购自衡阳市血站。

1.2方法

1.2.1 HDL3和oxHDL3的制备和鉴定 HDL3的制备：采用密度梯度超速离心的方法分离健康人血浆中的HDL（1.063～1.21 g/mL）、HDL2（1.063～1.125 g/mL）、HDL3（1.125～1.21 g/mL）；oxHDL3的制备：HDL3于4℃用PBS透析24 h后。1 mg/mL HDL3在37℃与含20 μmol/L CuSO4的PBS溶液孵育24 h。4℃，用含0.1% EDTA的PBS透析24 h，换液1次/8 h。BCA法蛋白定量，过滤除菌，4℃避光保存。HDL3和oxHDL3的鉴定：将HDL3和oxHDL3分别进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，oxHDL3电泳迁移率明显快于HDL3表明已经被氧化修饰。

1.2.2细胞培养 HUVEC-12贴壁生长于10%小牛血清RPMI-1640基础培养液中，培养液中含1%丙酮酸钠、1%谷氨酰胺、100 IU青霉素和链霉素，在37℃、5%CO2培养箱中静置培养。每次实验前24 h换新鲜培养基后加处理因素。

1.2.3细胞总RNA提取和逆转录-聚合酶链反应 收集细胞，总RNA提取试剂提取总RNA。根据之前研究[3]，t-PA引物序列上游：5-GAGCCAAGGTGTTTCAACG-3，下游5-CCCATTCCCAAAGTAGCAG-3，PCR扩增产物长度399 bp；内参照采用GAPGH，引物序列上游5-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3，下游5-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3，PCR扩增长度为697 bp。PCR反应条件：94℃下5 min预变性，94℃下30 s变性，58℃下30 s退火，72℃下45 s延伸，35个循环，72℃ 10 min继续延伸。反应结束后，取RT-PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶电泳中电泳。

1.2.4统计学处理 实验所得数据均为均数±标准差（x±s），组间采用方差分析及t检验，由SPSS 11.0统计软件完成，P

2结果

2.1 HDL3氧化修饰前后鉴定 琼脂糖凝胶电泳显示，见图1，HDL3成一条带。经20 μmol/L CuSO4孵育20 h后，由于阴离子含量增多，oxHDL3电泳迁移率明显快于天然的HDL3，表明已被氧化修饰。

2.2 oxHDL3对HUVEC-12细胞t-PAmRNA表达的影响 分别用不同浓度的HDL3、oxHDL3（0 mg/L，20 mg/L，40 mg/L，80 mg/L）孵育HUVEC-12 24 h后，用RT-PCR方法检测各组t-PA mRNA 的水平，见图2。结果显示，与0 mg/L oxHDL3组相比，20 mg/L、40 mg/L，80 mg/L oxHDL3浓度组细胞t-PAmRNA的表达均有所减少，以80 mg/L浓度组减少最明显，较0 mg/L oxHDL3组下降了30%（P

3讨论

本研究发现HDL氧化修饰后在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥了重要作用。此外，我们还发现，oxHDL2，oxHDL3这两种亚型在动脉粥样硬化的发生发展过程中的作用有所差异。值得注意的是本研究发现oxHDL3显著下调HUVEC-12细胞t-PA的表达。这表明，oxHDL3在动脉粥样硬化的发生发展过程中可能发挥了更为重要的作用。最近有文献报道[4]，小而密HDL具有较强的抗氧化活性和抗炎作用，而小而密HDL主要为HDL3，提示此种类型的HDL的修饰改变将导致更严重的后果。这也进一步证明了oxHDL3的致动脉粥样硬化病理效应可能强于其他类型的氧化HDL。因此，进一步阐明oxHDL3参与动脉粥样硬化形成的病理生理作用和机制，为预防和控制动脉粥样硬化性疾病提供帮助显得尤为重要。

参考文献：

[1]Nakajima T， Matsunaga T， Kawai S， Hokari S， Inoue I， Katayama S， Nagata A， Komoda T. Characterization of the epitopes specific for the monoclonal antibody 9F5-3a and quantification of oxidized HDL in human plasma[J].Ann Clin Biochem， 2004，41（4）：309-315.

[2]卜梓斌，姜志胜，马珍妮，等.氧化高密度脂蛋白通过MAPKs信号转导途径诱导ECV304细胞表达组织因子[J].中国病理生理杂志，2009，25：636-641.

[3]彭湘萍，姜志胜，任重，等.高密度脂蛋白及其亚型氧化修饰后对人脐静脉内皮细胞损伤及TFPI-1表达的影响[J].中国动脉硬化杂志，2009，17：588-589 .

[4]Cutuli L，Pirillo A，Uboldi P， Kuehn H，Catapano AL.15-lipoxygenase-mediated modification of HDL3 impairs eNOS activation in human endothelial cells. Lipids. 2014，49（4）：317-26.